纤维环针刺法建立兔椎间盘退变模型的实验研究

邓燕青，李兵，彭小忠，李百川，卓祥龙，贺庆

(广西医科大学第四附属医院骨科，广西柳州 545005)

·论著·

纤维环针刺法建立兔椎间盘退变模型的实验研究

邓燕青，李兵，彭小忠，李百川，卓祥龙，贺庆

(广西医科大学第四附属医院骨科，广西柳州 545005)

目的建立一种稳定可靠、可重复性好、成功率高，且与人类退变相似的椎间盘退变模型。方法38只普通级新西兰大白兔，雌雄不计，随机选取2只动物用于研究兔腰椎的解剖学特点，另外36只动物用随机数字表法均分为模型组和对照组。模型组手术取右侧腹膜后入路，暴露至L5/L6、L4/L5椎间盘纤维环，予16 G穿刺针针刺纤维环；对照组同法暴露不进行针刺。分别于术前及术后4周对实验动物行X线和MRI检查，术后4周处死实验动物，取椎间盘标本行病理学检查。结果术后4周，X线和MRI检查显示模型组椎间盘高度明显降低、部分骨赘形成、终板硬化，T2加权像信号较术前明显降低、椎间盘颜色变黑变暗，髓核缩小或消失，纤维环变厚；而对照组椎间盘未见明显变化，T2加权像呈均匀高信号；取椎间盘标本经HE染色，电镜下见模型组髓核组织明显缩小，结构紊乱，细胞密度较小，纤维向内塌陷，纤维环板层出现明显断裂，排列不整齐，纤维环内层见少量毛细血管长入；对照组腰椎间盘病理学检查无明显退变表现；免疫组化见模型组椎间盘内TNF-α数量较对照组明显增多。结论该方法具有操作简单、可行、高效等优点，是建立椎间盘退变模型的一种可靠方法。

纤维环针刺法；椎间盘退变；动物模型

椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration，IDD)是一系列脊柱退行性疾病的发生前提和基础病理过程，临床上常表现为椎管狭窄、脊柱节段不稳、腰腿痛、颈椎病、椎间盘突出等病症。传统的观点认为IDD主要与过度的身体负荷引起的损伤以及衰老过程中伴随出现的变化有关，其退变过程是一个很复杂的生理和病理学反应，牵涉到一系列的形态学、生物学、病理学和生物化学等方面的改变，其具体发病机制目前尚未完全清楚。本研究主要是通过针刺纤维环建立椎间盘退变模型，为人类椎间盘退变疾病的研究提供一种可靠的模型。

1 材料与方法

1.1 主要设备与试剂3.0T MRI(德国西门子公司)，DR机(日本津岛公司)，病理切片机(德国Leica公司)，光学显微镜及显微照相系统(日本Olympus公司)，常规手术器械及动物外科手术台(广西医科大学第四附属医院生物研究所)，16G无菌穿刺针(广西医科大学第四附属医院消毒供应中心)，戊巴比妥钠(北京普博斯生物科技有限公司)，TNF-α试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)、青霉素(华北制药集团)，0.9%生理盐水(NS)、4%甲醛(自配)。

1.2 实验动物及分组38只普通级新西兰大白兔(由广西医科大学动物实验中心提供)，雌雄不计，排除病兔及孕兔，平均年龄6个月，体质量(2.5±0.5)kg。随机选取2只动物用于研究兔腰椎的解剖学特点，另外36只动物用随机数字表法均分为模型组和对照组。实验过程中对动物的处置符合2009《Ethicalissues in animal experimentation》动物伦理学标准。

1.3 兔腰椎解剖学特点随机取2只新西兰大白兔，其中一只动物予空气栓塞处死，取下其腰椎及骨盆，剔除肌肉及软组织后，用碱水煮掉残余组织，完全暴露腰椎，另一只动物予静脉麻醉，剥离肌肉软组织，暴露腰椎；对比分析腰椎的解剖学特点(如图1)。研究发现兔的腰椎有7个椎体，在形态学上L1～L7椎体逐渐增大，椎体两端扁平，中部凹陷，且沿椎体纵轴前方有骨性棘样突起。椎弓发出的突起有三种，包括棘突、横突和关节突。棘突1个，较宽短，位于椎弓背侧正中，指向背前方；横突1对，细而长，自椎弓向两侧呈弧形伸展，伸向外侧前下方，无肋骨附着。L1～L3横突较短，L4～L7横突较长。解剖活兔腰椎发现L7横突位于髂骨覆盖之下，且较L6、L5、L4横突短而小，暴露较困难，从外体上自尾部往头侧探摸，摸到的位于髂骨下的第一个横突就L7横突，通过C臂机透视和在枯骨上可得到证实，继续往后探摸可依次摸到L6、L5、L4横突。相邻椎体间的关节由关节突连接，自椎体向前伸出1对前关节突，向后伸出l对后关节突。棘突基底部两侧有l对乳突，伸向背前方，较棘突稍低。从形态学上观察，兔椎间盘位于相邻椎体之间，活体椎间盘纤维环呈银白色，厚度约为3 mm，中间的椎间盘隆起凸出。从腰椎侧面纵向观察，腰椎横突与腰椎纵轴成约45°夹角，呈“r”形，椎间盘位于“r”形区域的夹角根部往头侧约2 mm处，纤维环呈银白色。

图1 兔腰椎解剖

1.4 建立动物模型

1.4.1 术前准备术前禁食24 h，实验动物称重，计算所需要的麻醉药物用量，使用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)通过耳缘静脉进行麻醉。麻醉好后予X线和MRI检查，可排除脊柱先天性畸形和椎间盘病退变，术前备皮(使用硫化钡对术区进行脱毛)。

1.4.2 造模方法术前准备完善后，实验动物取左侧卧位，固定于手术台上，通过探摸横突定位好L5/L6和L4/L5椎间盘区域，作好标记(在C臂机透视下证实探摸定位准确)，术区予碘伏消毒，铺无菌巾。经右侧腹膜后入路，沿右侧肋弓下缘与右髂嵴之间的连线取长约3 cm直切口。切开皮肤、皮下筋膜、腹外斜肌、腹内斜肌，钝性分离至L6横突，沿着横突两侧行骨膜下分离肌肉附着点，剥离至L6横突根部，暴露“r”形区域，剥离软组织，完全暴露L5/L6椎间盘纤维环右侧部分，见兔椎间盘位于相邻椎体之间，中间的椎间盘隆起凸出，纤维环呈银白色，触及有弹性，反复确定椎间盘的节段。根据新西兰大白兔的解剖学特点，穿刺针可取与下位椎体横突平面呈30°角方向进针(图2)，用16G无菌穿刺针穿刺到L5/L6椎间盘纤维环，当穿过纤维环时可有明显的突破感，穿刺深度控制约5 mm，连续穿刺3次，穿刺后可见针尖管内有乳白色果冻状髓核组织带出，即穿刺成功；延长切口穿刺L4/L5椎间盘纤维环；对照组同法暴露至L5/L6、L4/L5椎间盘纤维环，只暴露不进行穿刺。术毕，生理盐水冲洗伤口，止血，逐层缝合，辅料包扎伤口；予臀部肌肉注射青霉素(20万U/次)预防感染，待麻醉清醒后放回笼中继续饲养。

图2 穿刺点下

1.4.3 术后处理术后将兔子放回笼中饲养，禁食禁饮6 h后给予普通饮食；术后连续3 d肌肉注射青霉素(20万U/次，2次/d)，隔日伤口换药(总共3次)，预防伤口感染。每日观察每只兔的精神及活动状况，注意观察是否有感染、瘫痪或死亡等异常。

1.5 观察指标

1.5.1 X线检查分别于术前、术后4周拍摄腰椎侧位X线片，通过CAD软件测量术前及术后椎间盘高度，计算出椎间盘高度指数(Disc height index，DHI)，将椎间盘高度指数百分比(%DHI=术后DHI/术前DHI×100%)作为评估椎间盘的高度变化的指标[1]。

1.5.2 MRI检查分别在术前、术后4周行腰椎MR(西门子Magnetom Skyra 3.0T MRI，膝关节线圈，检查参数：TR=3 500，TE=135，thickness=2 mm，spacing=0)T2矢状位扫描，获得每个椎间盘的T2加权像，所有动物均采用相同的扫描序列。实验动物取仰卧位，固定好后置于检查台上，注意保持实验动物腰椎成直线，使中间的扫描线经过椎间盘的中份。术后4周退变椎间盘表现均以低信号为主，即T2加权像信号强度降低，且椎间隙变窄。将椎间盘退变Pfirrmann分级系统作为MRI的评估标准(见表1)[2]。

分级ⅠⅡⅢⅣⅤ髓核结构结构完整，均匀一致，白亮结构完整，欠均匀，灰色带欠完整，灰色，亮度下降不完整，灰黑色信号不完整，黑色信号髓核与纤维环分界清楚清楚欠清楚消失消失信号强度接近脑脊液高，接近脑脊液中等中等到低信号低信号椎间隙高度正常正常正常或稍窄稍窄狭窄明显

1.5.3 病理学检测取标本前先对实验动物进行心脏灌注，依次为0.9%NS，4%甲醛，灌注完后，完整取下L4/L5和L5/L6椎间盘，予4%多聚甲醛固定，5%硝酸脱钙，常规处理后石蜡包埋，正中矢状切面切片，片厚4 μm。取组织切片，进行常规HE染色，在光学显微镜下观察。部分椎间盘组织切片按照肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒的要求进行免疫组化染色，检测椎间盘内TNF-α的活性。

1.6 统计学方法各组数据应用SPSS16.0软件采用方差分析进行统计学处理，并进行组间分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

术中因麻醉意外死亡1只，已及时补充，余动物均活动自如，无瘫痪和死亡发生，术口愈合良好，无感染发生；实验组和对照组分别为18只动物，共计责任椎间盘72个。

2.1 影像学表现

2.1.1 X线影像学变化术后4周腰椎侧位X线片显示模型组椎间隙变窄、软骨终板钙化以及部分骨赘形成等(如图3)；对照组椎间盘未见明显变化。术后4周测得椎间盘高度指数百分比：模型组L4/L5、L5/L6和对照组L4/L5、L5/L6分别为(69.3±4.2)%、(68.1± 1.8)%、(99.4±0.6)%、(99.1±0.8)%。模型组的椎间盘高度指数百分比明显比对照组的低，差异有显著统计学意义(P＜0.001)。

图3 术前及术后4周X线片(A、B)、MRI(C、D)对比

2.1.2 MRI影像学变化术后4周，模型组椎间盘MRI T2加权像信号较术前明显降低、椎间盘颜色变黑变暗，髓核缩小或消失，纤维环变厚，椎间盘高度明显下降(如图3D)，对照组椎间盘MRI T2加权像始终呈均匀高信号。术后4周椎间盘退变MRI Pfirrmann分级结果见表2，造模4周后结果：模型组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。说明模型构建后4周髓核信号强度降低明显。

表2 术后4周椎间盘退变MRI Pfirrmann分级（只）

2.2 组织病理学表现

2.2.1 组织大体观可见对照组和模型组髓核组织居中，均为胶状物、粘稠，纤维环较厚，且整齐，包绕髓核；对照组椎间隙清晰，纤维环及髓核的界限清楚(图4A)。模型组椎间盘髓核组织泛黄，界限不清，切明显萎缩，纤维环排列紊乱，质地脆而硬，穿刺处纤维环外环可见部分纤维软骨形成(图4B)。

图4 椎间盘组织大体观

2.2.2 显微镜下观经HE染色后，光学显微镜下见对照组髓核细胞均匀分布，形态正常，纤维环呈板层结构；模型组髓核组织明显缩小，结构紊乱，细胞密度较小，纤维向内塌陷，纤维环板层出现明显断裂，排列不整齐，纤维环内层见少量毛细血管长入。

2.2.3 免疫组化TNF-α的活性是椎间盘退变的重要指标[3-4]。按照TNF-α试剂盒检测椎间盘内TNF-α的活性结果显示，模型组椎间盘内TNF-α数量较对照组明显增多。

3 讨论

椎间盘退变动物模型研究的根本在于模拟人椎间盘退变后在组织水平、细胞水平甚至分子水平等方面的变化，通过建立椎间盘退变动物模型，可以从形态学、生物化学、组织免疫学、影像学和分子生物学等多角度、多方向对椎间盘退变过程、病因及发病机制进行详尽的研究，以助于阐明人椎间盘退变的发生机理，以期为椎间盘退变的预防和治疗提供依据。

稳定可靠的椎间盘退变动物模型需要满足以下条件[5]：(1)在伦理学上具有可行性；(2)与人椎间盘退变过程具有相似性和可比性；(3)可重复性好；(4)易于操作且经济实用。既往有用猪、羊、犬等大型的动物作为造模动物，因麻醉、手术方法、饲养方法等的特殊性，及费用昂贵和对实验条件要求较高等因素而未能广泛使用。而大鼠或小鼠等小型动物，虽易于饲养、费用低廉、对实验条件要求也不高，但由于其椎间盘太小、造模难度较大、成功率较低、影像学表现不明显等因素亦没有被推广。新西兰大白兔具有价格低廉、饲养方便、抵抗力强、结果可靠、适合大规模实验等优点，且其椎间盘在解剖和生化结构上与人类椎间盘非常相似，因此本实验选用新西兰大白兔作为实验动物。成年新西兰大白兔腰椎有7个椎体，其横突与腰椎纵轴成约45°夹角，呈现“r”形，椎间盘则位于“r”形区域内的两个椎体之间，椎间盘纤维环呈银白色，较易辨认；其解剖学特点决定了其具有易于暴露、定位准确、直观、可操作性好、重复性高等优点。

有研究表明椎间盘髓核的退变率与纤维环受损程度密切相关[6]，本实验采用针刺纤维环建立椎间盘退变模型也是基于此机制。近年来国外研究人员提出：针刺纤维环造成纤维环结构破坏、椎间盘弹性降低，使椎间盘形成了一个新的液体通道，改变了髓核的液体压力，影响了整个椎间盘的应力，尤其是轴向应力的改变，继而造成了椎间盘退变[7-8]。椎间盘内部的髓核组织被内外层纤维环与上下软骨终板紧密包绕，与周围循环毫无法接触，且椎间盘内缺乏血管，因此其营养主要来自软骨终板。所以髓核组织与机体免疫系统也是无法接触的。当刺破纤维环或软骨终板这一生理屏障后，髓核组织就会暴露于免疫系统之中，从而引发自身免疫反应，导致髓核细胞凋亡，炎性细胞侵润，导致椎间盘退变[9-11]。

造模4周后选用了X线、MRI及组织病理学检查作为观察指标[12]。X线片能够提供椎间盘高度降低、骨赘形成及椎间盘钙化等病变信息，MRI能够提供T2加权像信号减低、椎间盘高度下降髓核缩小或消失等退变信息，本研究结果X片及MRI的结果椎间盘高度的丢失、塌陷提示椎间盘退变明显，表明椎间盘高度是定量分析椎间盘退变程度的重要指标，与人类椎间盘退变过程相似。MRI已成为诊断椎间盘退行性改变最精确的检查手段之一，MRI能够描述椎间盘的水分含量以及形态学变化[13-14]。椎间盘退变，髓核水分丢失，导致椎间盘高度下降，椎间隙变窄。T2加权像对含水量高的组织表现为高信号，而低信号则反映组织脱水、蛋白多糖含量减少、硫酸软骨素与角质素比率下降等改变[15]，脱水是椎间盘退变的开始，伴随水分减少和胶原浓度增加，糖蛋白增多，椎间盘纤维化且变硬，其维持高度和分散负荷的能力逐渐下降，从而导致椎间盘高度降低，且在MRI T2加权像上表现为低信号。病理学检查已成为研究IDD的重要手段，其中HE染色是研究椎间盘组织形态变化最重要的技术，能够清楚地显示各层组织结构[16]；有国外文献报道[17]：退变椎间盘髓核皱缩变小、纤维化、呈灰黄色；纤维环与髓核分界不清，正常结构消失；椎间盘前部纤维增生，毛细血管长入，肉芽组织增生；髓核弹性降低，对纤维环产生异常应力，导致自身胶原的变性、溶解，而引起椎间盘退变。各种细胞因子地变化也是IDD的重要表现，有可靠证据表明[3-4]：TNF-α也是神经源性疼痛发生、发展的关键调节因子，被认为是一种神经调变剂可以诱导炎症反应和神经张入退变的椎间盘，在退变椎间盘中表达增高。符合本实验病理学检查结果。

本造模方法具有操作简单，对实验条件要求低，定位准确，成功率高，观察指标明确，重复性好，且符合人类椎间盘退变规律等优点，为腰椎间盘退变的研究提供了一种简便、可行、高效的模型研究方法；为进一步研究椎间盘退变性疾病提供了一种可靠的动物模型。

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Construction of rabbit model of intervertebral disc degeneration induced by needle acupuncture in annulus fibrosu.

DENG Yan-qing,LI Bing,PENG Xiao-zhong,LI Bai-chuan,ZHUO Xiang-long,HE Qing.Department of Orthopaedics,the Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Liuzhou 545005,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo establish a reliable,reproducible rabbit model of intervertebral disc degeneration with high success rate.MethodsThirty-eight new Zealand white rabbits of general level,excluding male and female,were enrolled in the study.Two rabbits were randomly selected for the study of the anatomy of the lumbar spine, and the remaining 36 rabbits were randomly divided into model group and control group.The model group after surgery took the right retroperitoneal approach,exposure to L5/L6,L4/L5intervertebral disc,16 G needle acupuncture the annulus.The control group was not exposed to the same method puncture.Preoperative and postoperative four weeks, X-ray and MRI examination were performed.Animals were sacrificed after 4 weeks,and the disc specimens were taken for pathological examination.ResultsAfter 4 weeks,X-ray and MRI examination showed that the disc height in the model group significantly reduced,with partial osteophyte formation and endplate sclerosis,T2-weighted images before the signal was significantly lower than the preoperative,with darkening disc,shrinking or disappeared nucleus, thickening annulus,and decreased disc height.The disc showed no significant change in the control group,T2-weighted images showed homogeneous high signal.The disc specimens were taken for HE staining and electron microscopy, which showed significantly reduced nucleus pulposus,structural disorder,smaller cell density,fiber collapse inward, anular lamellar apparent fracture,irregular arrangement,a small amount of the annulus inner capillary in growth in the model group.Rabbits in the control group had no significant performance of lumbar intervertebral disc degeneration. Immunohistochemistry showed the number of TNF-α of the model group increased significantly compared with the control group.ConclusionThis method is simple,practical and efficient,which is a reliable method to establish the model of disc degeneration.

Needle acupuncture in annulus fibrosu;Intervertebral disc degeneration;Animal model

R-332

A

1003—6350（2014）05—0625—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.05.0246

2013-12-09)

广西区自然科学基金（编号：2010gxnssa013257）

李兵。E-mail:aceonelee@gmail.com