高效液相色谱－蒸发光散射检测薯蓣皂甙元

朱小燕，雷新荣，严春杰，沈 翔

（1.中国地质大学（武汉）材料与化学学院，湖北 武汉 430074；

2.中国地质大学（武汉）纳米矿物材料及应用教育部工程研究中心，湖北 武汉 430074）

薯蓣皂甙元（diosgenin），商品名为薯蓣皂素，简称皂素，分子式C27H42O3，分子结构式见图1，化学名△5－异螺旋甾烯－3β－醇，属异螺旋甾烯烷的衍生物，为薯蓣科薯蓣属植物根茎中薯蓣皂甙的水解产物［1］。

它以糖甙的形式广泛存在于自然界的植物中，尤以薯蓣科含量最多。世界各国生产的甾体激素60%以上用它为原料。甾体激素应用广泛，目前，大约有400多种药物以薯蓣皂素为生产原料或中间体［2］。我国薯蓣皂素年产量4 000t以上，占全球产量的90%，其中2／3用于直接出口［3］。利用黄姜生产薯蓣皂甙元的制备方法包括酸水解法、物理分离法、自法和超声发酵法、酶水解法、超临界流体萃取法等［4］。

1 薯蓣皂甙元检测方法简述

当前薯蓣皂素价格约95万元／吨［3］。测试方法的不同及结果的偏差都会带来贸易的纠纷。因此，具体工作中选择何种方法检测是一个需要考虑的问题。国内外报道的薯蓣皂甙元检测方法早有重量法［5］、薄层比色法［6］、紫外分光光度法［7］、旋光法［8］、红外光谱结合核磁共振的方法［9］、薄层扫描法［10］、气相色谱法（GC）［11］、高效液相色谱法（HPLC）［12］等。2002 年陕西省依据此发布《黄姜薯蓣皂素》DB61／T 302—2002的地方标准，该标准即以皂素熔点的高低作为判断黄姜皂素合格与否、优质与否的重要判断依据。但缺点是时间长，易造成观测误差，仪器造成的系统误差较大，人为因素较多，产生了定性不准的缺点［13］。

图1 皂素分子结构

高效液相色谱法测定薯蓣皂甙元含量不需要进行分离，也不需要进行衍生化，减少了检测操作步骤，且测试更快更准，被越来越广泛地应用于薯蓣皂素的检测［4］。对薯蓣皂甙元检测分析的研究目前多采用此法，采用正相或反相色谱法，二者均采用末端吸收波长进行检测［14］。早期多采用正相色谱法，现在反相色谱法应用最为广泛（约占HPLC分离分析的70%～80%［15］），因为反相色谱法在近紫外区透明度较好，背景吸收相对较低。但，如果样品在紫外光区的吸收信号太弱，流动相对其影响较明显。

蒸发光散射检测器（ELSD）可用来测定那些不能用紫外检测器、荧光检测器检测的组分，消除了常见于传统HPLC检测方法中的难点，它的响应不依赖样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。因此，本文尝试建立薯蓣皂甙元的HPLC－ELSD分析方法，并将此方法与已有文献中所用的高效液相色谱法作对比，使学生更深入地理解HPLC测试及数据处理的方式方法。本文所采用方法快速、方便、准确度高，也适合于用户的测试需求。

2 实验

2.1 主要实验仪器和试剂

仪器：Dionex p680液相色谱仪；AllTECH 蒸发光散射检测器ELSD2000。

试剂：HPLC分析用甲醇为色谱纯；HPLC分析用水（18.2MΩ·cm，总有机碳量为3mg／L）由 Millipore纯水机制备；皂素标样购自于北京恒元启天化工技术研究院；其他化学试剂均为分析纯，一般用水为去离子水；薯蓣皂甙元产品利用环保酸浸法从黄姜中提取获得［16］，制得薯蓣皂甙元含量不同的3个样品记为Sample1、Sample2、Sample3。

2.2 实验方法

2.2.1 标准溶液的配制

准确称取皂素200mg用色谱级甲醇溶于10mL容量瓶中，作为母液；从母液中移取0.5、1、1.5、2mL溶于10mL容量瓶中定容，经0.45μm微孔滤膜过滤，测试。

2.2.2 样品溶液配制

称 取 Sample1、Sample2、Sample3 3 种 样 品 各0.02g定容于10mL容量瓶中，利用乙醇溶解；从10 mL中分别取1mL定容于10mL容量瓶中，甲醇定容，经0.45μm微孔滤膜过滤。用Dionex p680液相色谱仪和AllTECH蒸发光散射检测器ELSD2000进行测试。

2.2.3 HPLC－ELSD分析条件

色谱柱：ZORBAX SB－C18（4.6mm×150mm，5μm），柱温28℃，进样量10μL。

流动相：V（水）／V（乙腈）＝1 090（等梯度）。

ELSD：气 流 流 速 1.2mL／min，漂 移 管 温 度80℃。

2.2.4 常规HPLC方法对比测试

样品制成0.5g／L溶液与标样（对照品）注入液相色谱仪检测含量。采用文献［13］的检测条件：流动相：V（甲醇）∶V（水）＝84∶16，流速为1.0mL／min；进样量为20μL；检出波长为210nm［13］。检测柱：C18反相柱。仪器为Agilent1220型高效液相色谱仪。

3 结果与讨论

3.1 流动相的选择

选用V（甲醇）∶V（水）＝95∶5［17］，V（甲醇）∶V（水）∶V（乙腈＝30∶20∶50）［18］，V（乙腈）∶V（水）＝90∶10［19］，V（石油醚）∶V（异丙醇）＝98∶2［20］为流动相进行比较。结果表明：水和甲醇的流动相中，溶剂甲醇有较大的背景吸收，因此灵敏度较低；采用10%水和90%乙腈等梯度洗脱程序时，峰形对称性好，分析效果最为理想。

3.2 工作曲线

按2.2.3节的HPLC条件，分别将质量浓度配制成0.1、0.2、0.3、0.4g／L的标准溶液系列样品进样。每个浓度平均测试5次，以皂素的峰面积为纵坐标，以皂素的质量浓度为横坐标绘制工作曲线（见图2），得到线性方程y＝138.5x－3.280，R2为0.996，y为面积，x为标样质量浓度，R为相关系数。

图2 薯蓣皂素工作曲线

3.3 样品的 HPLC－ELSD测试

按2.2.2节方法制备样品溶液，并按2.2.3节方法测定。色谱图见图3，测定结果表明，3个样品中薯蓣皂甙元的含量（质量分数）如表1所示。5次测定值的相对标准偏差为1.2%。

图3 样品Sample1、Sample2、Sample3的 HPLC－ELSD色谱图

表1 样品的HPLC－ELSD的测试

3.4 样品的HPLC对比测试及其存在的问题

按2.2.4节的 HPLC条件，分别将标准样品（STANDARD SAMPLE）按质量浓度配制成0.1、0.2、0.3、0.4g／L的标准溶液系列样品进样。通常，学生所得数据无法得到较好的拟合标准曲线。于是，学生将标样及3种样品都配制成0.2g／L进行直接测试，得到图谱见图4。并且，按文献［21］所提供的公式计算：

其中，cx供测试品的质量浓度，cR对照品的质量浓度，Ax供测试品的峰面积，AR对照品的峰面积，mR对照品质量，mx供测试品质量。

按式（2）计算得到的Sample1、Sample2和Sample3薯蓣皂甙元的质量分数分别为36.65%，28.81%和21.84%。与HPLC－ELSD方法所测的结果相差太大。主要原因是：①样品在210nm处紫外吸收太弱，数据信号不强；②计算公式（2）不可以直接应用，因为，峰面积与含量之间对应并不是1∶1的关系，而是以一定系数的线性方程所得。因此，利用HPLC测试皂素的数据在实际应用中存在着较大的问题，而利用HPLC－ELSD测试ELSD的优势得到体现。

4 结论

本文建立了黄姜皂素产品中皂素测定的高效液相色谱－蒸发光散射检测方法，消除了样品紫外吸收弱的影响，提高了定量的准确性。通过对比测试，让学生理解了HPLC测试过程及数据处理中应该注意的问题。而且该方法操作简便，省去了固相萃取步骤，缩短了检测周期，也可满足实际检测工作的需要。

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图4 样品Sample1、Sample2、Sample3及STANDARD SAMPLE的HPLC色谱图

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