E-cadherin在积水肾组织中的表达及意义

李又空，周家杰，张先觉，钟雯，郭华雄

(荆州市中心医院泌尿外科1、内分泌科2、病理科3，湖北荆州434200)

E-cadherin在积水肾组织中的表达及意义

李又空1，周家杰1，张先觉1，钟雯2，郭华雄3

(荆州市中心医院泌尿外科1、内分泌科2、病理科3，湖北荆州434200)

目的研究不同程度积水肾组织中E-cadherin mRNA基因及蛋白表达。方法50例患者，年龄18～75岁，通过肾脏彩超将其分为轻度、中度、重度肾积水，每组分别为15例、18例、17例，同时选取健康体检正常人群50例作为对照组；肾脏穿刺取肾皮质组织，Realtime RT-PCR及Western blot分别检测各组E-cadherin mRNA基因及蛋白表达；分析E-cadherin表达与肾积水程度之间的关系。结果正常对照组肾脏表达非常丰富的E-cadherin mRNA基因及蛋白，而积水肾组织中E-cadherin mRNA基因及蛋白表达均显著下降；同时随着积水程度的不断加重，E-cadherin表达水平进行性下降，并与肾积水程度之间存在明显负相关关系。结论肾积水将通过不同机制下调E-cadherin表达，并进而通过EMT等中间环节导致肾小管间质纤维化，E-cadherin在其中起着非常重要的作用。

E-钙黏连蛋白；肾积水；肾小管间质纤维化

梗阻所致肾积水是泌尿外科常见多发病，随着积水程度的不断加重将出现肾小管间质纤维化，并将直接影响肾功能[1]。目前大量研究均希望能够通过深入研究其发生发展的分子机制，达到减轻甚至逆转肾小管间质纤维化这一病理过程。E-钙黏连蛋白(E-cadherin)是研究热点之一。本研究拟通过检测不同程度积水肾组织中E-cadherin mRNA基因及蛋白的表达，探讨其在肾积水纤维化中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料50例患者来源于2013年1～5月于我院泌尿外科住院治疗肾积水患者，均经彩超及CT平扫明确肾积水诊断。其中男性28例，女性22例，年龄18～75岁。所有患者均于彩超定位下通过肾脏穿刺活检取肾皮质组织。部分组织浸泡于10%多聚甲醛溶液中固定，24 h后常规包埋、切片；另一半组织迅速置入液氮中，再转入-80℃保存。通过肾脏彩超将其分为轻度、中度、重度肾积水，每组分别为15例、18例、17例，同时选取健康体检正常人群50例作为对照组。

1.2 超声分级根据超声结果对所有患者肾积水进行分级[2，3]。轻度肾积水：肾外形和肾实质无改变，仅见肾窦部出现窄带状或扁卵圆形无回声区，肾盂轮廓饱满，肾小盏轻度扩张，肾锥体顶端变形，肾盂分离15～25 mm；中度肾积水：肾窦区显示“手套状”或“烟斗状”无回声区，肾小盏的终末端和肾锥体顶端轮廓变平坦，肾外形和肾内其余结构物明显改变，肾盂分离25～35 mm；重度肾积水：肾体积明显增大，肾皮质变薄甚至完全萎缩，肾盂肾盏变形，肾窦区囊性扩张，肾盂分离大于35 mm以上。肾实质不同程度萎缩为重度肾积水的特征。根据上述标准将所有患者分为轻度、中度、重度肾积水三组，分别为15例、18例、17例。

1.3 主要试剂兔抗人E-cadherin多克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司；Trizol试剂及LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；RT试剂盒购自Fermentas公司；SYBR Green 1实时荧光定量PCR试剂盒购自Toyobo公司；辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗，BCA蛋白浓度测定试剂盒、电化学发光物试剂盒、SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物公司。

1.4 免疫组化检测E-cadherin表达石蜡切片常规脱蜡后，微波修复15 min，然后依次滴加过氧化物酶封闭液、正常山羊血清封闭液(37℃孵育20 min)、兔抗人多克隆抗体(1:100，37℃孵育30 min，之后4℃湿盒过夜)、生物素标记的二抗(37℃孵育20 min)、SABC(37℃孵育20 min)，最后滴加DAB显色5 min，苏木素复染后脱水封片。

1.5 Western blot检测E-cadherin蛋白表达提取各标本总蛋白并定量，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质后转膜，37℃封闭1 h，一抗(1:1000)4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育2 h，洗膜后ECL显影，暗室压片曝光。所有实验均重复3～5次。所得到蛋白条带经扫描后计算各条带与内参Actin吸光值(A值)的比值，此代表各标本中Nodal蛋白表达含量。所有实验均重复3～5次。

1.6 Realtime RT-PCR检测E-cadherin mRNA基因表达按照试剂盒说明书提取组织总RNA，并将其逆转录成第一链cDNA。E-cadherin引物序列为：正义5'-TGAGAACGAGGCTAACG-3，反义5'-GCTGTGGAGGTGGTGAG-3'；Actin引物序列为：正义5'-GGCACCACACCTTCTACA-3'，反义5'-AGTGGA AGAGTG-3'。PCR反应在Bio-Rad iQ5 Real-Time PCR Detection System上进行，通过测定PCR扩增过程中与双链DNA非特异性结合的SYBR GREEN 1染料荧光强度来反映PCR产物的表达量。总的反应体系为10 μl，上下游引物浓度均为10 μmol/L，具体反应条件如下：95°C预变性5 min，然后95°C变性20 s，62°C退火30 s，72°C延伸30 s，共40个循环，最后总延伸时间为5 min。以混合样本作为模板稀释成不同浓度梯度进行PCR反应后所得结果绘制标准曲线，计算各基因的扩增效率，GAPDH为内参基因，各目的基因表达含量通过均数±标准差(±S)来表示，通过2-ΔΔCt法解析各目的基因mRNA的表达并进行相应比较[4]。所有实验均重复3～5次。

2 结果

2.1 免疫组化检测积水肾组织中E-cadherin蛋白的表达免疫组化结果显示，正常肾组织中E-cadherin表达非常丰富，其表达集中于小管上皮细胞的细胞膜及细胞相互接触的间隙中，说明其在细胞间连接中发挥着非常重要的作用。而随着肾积水的不断发展，其表达不断下降，阳性染色细胞数目不断减少，结果见图1。

图1 免疫组化检测E-cadherin蛋白表达(×200)

2.2 积水肾组织中E-cadherin蛋白及mRNA基因的表达Western blot检测不同级别积水肾组织中E-cadherin蛋白的表达，结果提示正常对照组肾脏表达非常丰富的E-cadherin蛋白，而随着积水程度的不断加重E-cadherin表达不断下降(P＜0.01)，见图2。Realtime RT-PCR结果提示，正常对照组肾组织中E-cadherin mRNA表达丰富，随着积水程度的不断加重其mRNA基因表达不断下降(P＜0.01)，其下降趋势与蛋白表达的下降趋势一致，见图3。

图2 Western blot检测E-cadherin蛋白表达

图3 Realtime RT-PCR检测E-cadherin mRNA基因表达

2.3 E-cadherin表达与积水分级相关性分析相关性分析结果提示，E-cadherin蛋白表达与积水程度之间存在负相关关系(r=-0.612 5，P＜0.01)，其mRNA基因表达水平与积水程度之间同样存在负相关关系(r=-0.622 0，P＜0.01)，因此E-cadherin表达与肾积水严重程度呈明显负相关。

3 讨论

尿路梗阻所致肾积水是泌尿外科常见多发病，肾积水最终将导致肾小管间质纤维化，并直接影响肾功能衰竭[5]，研究梗阻性肾积水所致肾小管间质纤维化发生发展的分子机制具有非常重要的意义。

E-cadherin是一类主要介导细胞间粘附的钙依赖性跨膜糖蛋白，是细胞粘附分子中的一种。其主要存在于人和动物的上皮细胞，参与形成和维护正常细胞间的连接，对维持正常上皮细胞形态和结构完整性起着非常重要的作用[6]。本研究中，免疫组化结果提示正常对照组肾组织表达非常丰富的E-cadherin蛋白，且其表达集中于小管上皮细胞的细胞膜及细胞相互接触的间隙中，提示其在细胞间连接中发挥着非常重要的作用。而目前研究认为其表达下降或缺失将导致细胞极性改变容易分离，并将导致肾小管上皮细胞发生转分化(EMT)，转变为肌成纤维细胞并分泌大量细胞外基质(ECM)，直接导致肾小管间质纤维化的发生[7]。

彩超是目前临床评价肾积水程度常用检查手段，通过彩超检查可以较准确地了解积水肾脏集合系统分离程度。本研究中通过彩超检查评估将所有患者分为轻度、中度、中度肾积水三组，每组患者例数分别是15例、18例、17例。所有患者均经肾穿刺活检以取得部分肾皮质行相关检测。通过Realtime RT-PCR及Western blot检查发现正常对照组肾组织表达非常丰富的E-cadherin mRNA及蛋白，而积水肾组织中其表达水平明显下降，同时随着积水程度的增加E-cadherin mRNA及蛋白表达水平进行性下降。将E-cadherin表达的变化趋势与积水程度进行比较分析发现，E-cadherin mRNA基因及蛋白的表达变化趋势与积水程度之间存在负相关关系，即肾积水程度的不断加重可能是导致E-cadherin表达下降的直接原因。

我们推测其作用机制为持续的肾积水导致肾盂内压力增高，直接作用并损害小管上皮细胞[8]，并刺激增加转化生长因子-β1(Transforming growth factor，TGF-β1)、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)等细胞因子的分泌，间接作用于小管上皮细胞[9]。TGF-β1及CTGF是目前公认刺激EMT发生的细胞因子，在他们的作用下肾小管上皮细胞发生EMT，细胞间连接被破坏，即E-cadherin表达下降。

综上所述，本研究发现肾积水将通过不同机制下调E-cadherin表达，并进而通过EMT等中间环节导致肾小管间质纤维化，E-cadherin在其中起着非常重要的作用。

参考资料：

[1]Samarakoon R,Overstreet JM,Higgins SP,et al.TGF-β1→SMAD/ p53/USF2→PAI-1 transcriptional axis in ureteral obstruction-induced renal fibrosis[J].Cell Tissue Res,2012,347(1):117-128.

[2]陈炽贤.实用放射学[M].2版.北京:人民卫生出版社,1998: 685-700.

[3]曹海根,王金锐.实用腹部超声诊断学[M].2版.北京:人民卫生出版社,2006:238-289.

[4]Vandesompele J,De Preter K,Pattyn F,et al.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].Genome Biol,2002,3:8-12.

[5]Morcos M,SayedAA,BierhausaA,et a1.Activation of tubularepithelial cells in diabetic nephropathy[J].Diabetes,2002,51:3532-3544.

[6]Gheldof A,Berx G.Cadherins and epithelial-to-mesenchymal transition[J].Prog Mol Biol Transl Sci,2013,116:317-336.

[7]Zeisberg M,Kalluri R.The role of epithelial-to-mesenchymal transition in renal fibrosis[J].J Mol Med(Berl),2004,82(3):175-181.

[8]Sato Y,Feng GG,Huang L,et al.Enhanced expression of naofen in kidney of streptozotocin-induced diabetic rats:possible correlation to apoptosis of tubular epithelial cells[J].Clin Exp Nephrol,2010, 14(3):205-212.

[9]Chiarelli F,Gaspari S,Marcovecchio ML.Role of growth factors in diabetic kidney disease[J].Horm Metab Res,2009,41(8):585-593.

Expression and significance of E-cadherin in hydronephrosis.

LI You-kong1,ZHOU Jia-jie1,ZHANG Xian-jue1, ZHONG Wen2,GUO Hua-xiong3.Department of Urology1,Department of Endocrinology2,Department of Pathology3, Jingzhou Central Hospital,Jingzhou 434020,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of E-cadherin in different levels of hydronephrosis and investigate its clinical significance.MethodsFifty patients were enrolled in the study,with age of 18～75 years old.They were divided into mild,moderate and severe hydronephrosis groups,with 15,18 and 17 patients respectively.Fifty healthy people were selected as control group.Real time PCR and Western blot were used to detect the expression of E-cadherin mRNA and protein.Correlation analysis was applied to find out their relationships.ResultsE-cadherin was highly expressed in the control group,while its expression was low in the hydronephrosis groups.And the more severe the hydronephrosis was,the lower the E-cadherin expression level.The expression of E-cadherin was negatively correlated with the severity of hydronephrosis.ConclusionThe hydronephrosis would cause the downregulation of E-cadherin expression through many different mechanisms,and would cause tubulointerstitial fibrosis through EMT ultimately.E-cadherin playes very important roles during the process.

E-cadherin;Hydronephrosis;Tubulointerstitial fibrosis

R692.2

A

1003—6350（2014）20—2975—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.20.1171

2014-01-19)

荆州市科技发展计划项目(编号：2011)

李又空。E-mail：liyoukong@126.com