龙眼果干蛋白组成及不同组份特性比较

卜智斌等

摘 要 以龙眼果干为原料，利用碱溶酸沉法提取龙眼果干粗蛋白，并测定其等电点，研究不同等电点龙眼蛋白的含量及其氨基酸组成，配制人工胃液以模拟不同等电点龙眼蛋白的体内消化情况，测定等电点粗蛋白及其模拟体内消化液的总抗氧化能力。结果表明：龙眼蛋白提取过程中的最佳浸泡时间为2 h，其等电点为pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0，其中pI3.0、pI4.0、pI5.0组份蛋白含量分别占果肉总蛋白的12.69%、21.68%、17.12%， 均含有16种氨基酸，其中7种为人体必需氨基酸；不同等电点组份蛋白及其消化液总抗氧化能力有所不同，pI5.0粗蛋白的总抗氧化能力为276.33 U/mg Protein，显著高于另外2组等电点蛋白，而粗蛋白消化液总抗氧化能力最高为pI4.0蛋白，达154.72 U/mg Protein。

关键词 龙眼干；等电点；氨基酸；体外模拟消化；抗氧化

中图分类号 S667.2 文献标识码 A

Abstract Alkali-solution and acid-isolation methods were carried out to determination the isoelectric point of dried longan protein， to analyse the composition of different pI proteins from dried longan fruit， in vitro digestion of longan proteins in different pI was conducted in a simulated digestion environment and compared the total antioxidant activity of different pI protein and its digestive fluid. The results demonstrated that： the best extracting time for longan pulp static leaching was two hours； pH3.0， pH3.5， pH4.0， pH4.5， pH5.0 were the isoelectric points of dried longan fruit proteins， and the relative percentages of longan proteins in pI3.0， pI4.0， pI5.0 component from total dried longan fruit protein was 12.69%， 21.68% and 17.12% respectively， all including 16 amino acids with seven essential amino acids； Proteins and its digestive fluid in different pI had different total antioxidant capacity，and the pI5.0 component had the highest total antioxidant capacity， 276.33 U/mg Protein， while the digestive fluid of the pI4.0 component had the highest total antioxidant capacity compared to the others.

Key words Dried longan fruit；Isoelectric point；Amino acid；In vitro digestion；Antioxidant activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.020

龙眼（Dimocarpus longan Lour.）又名“桂圆、益智”，是无患子科龙眼属植物，为中国南方典型的亚热带水果之一。龙眼肉营养丰富，含有大量多酚、多糖、类黄酮等天然生物活性物质，是药食两用的滋补佳品[1]。中医认为，龙眼味甘、性温，入心脾两经，具有补益心脾、养血宁神等功效[2]，这与中国最早的药学专著《神农本草经》中所言龙眼“久服强魂聪明，轻身不老，通神明”之说相吻合。现代研究结果表明，龙眼具有抗氧化、抗衰老、抗应激、抗焦虑、影响内分泌等作用。

目前对龙眼果肉的研究主要集中在多酚、多糖类物质的分离、提取、纯化、功能活性评价方面[3-4]及龙眼干制加工研究[5]。龙眼功效的研究则多以龙眼肉提取液作为研究对象，如农兴旭等[6]、王慧琴等[7]用龙眼肉提取液通过体外及体内试验对龙眼肉的抗应激和抗衰老能力进行了研究。以龙眼肉提取液作为研究对象的缺点在于提取液中含有众多的物质，如多糖、维生素、蛋白质、氨基酸等，因此不能明确其作用机制。氨基酸是一种很重要的营养成分， 也是果实风味的重要物质[8]，与风味物质的合成密切相关，同多糖等其他大分子物质结合影响龙眼的药食功效作用，对龙眼干的品质影响较大[9]，另外，氨基酸与美拉德反应、褐变的发生密切相关，对龙眼的感官品质也有着直接的影响[10-11]。

而有关龙眼果肉蛋白、氨基酸这一类低成分含量物质的研究较少，主要是研究其氨基酸组成和含量测定，如戴宏芬等[12]采用高效液相色谱（HPLC）测定18个龙眼品种鲜果肉的氨基酸组成及含量；黄爱萍等[8]研究了果实采后低温贮藏过程中龙眼果肉氨基酸含量的变化。对于其等电点及活性性能方面的研究尚未见详细报道。实际上龙眼干制在由高水分含量降低至含水量15%以下的过程中，果肉中的蛋白质与糖发生美拉德反应等一系列复杂的反应，包括蛋白糖基化过程[13]，蛋白糖基化改性可显著改善蛋白质的溶解性、热稳定性、乳化性、凝胶性、粘度等各种性质，并能影响龙眼的抗氧化性、抗菌性、免疫活性等生物功能作用[14]。

在本试验中，主要研究龙眼果干蛋白的提取方法，初步分析确定龙眼果干蛋白粗提的最佳提取浸泡条件，对提取的不同等电点的粗蛋白进行体外模拟消化，测定其氨基酸成分和抗氧化能力等，旨在了解龙眼果干蛋白的组份和不同组份基本功能特性，为后续从蛋白质组学角度深入研究龙眼干的功能变化提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 龙眼果干为“储良”品种，购于广州某农贸市场，测定果肉中蛋白质含量为（3.66±0.22）%，水分含量为（8.09±0.03）%。

1.1.2 试剂 氢氧化钠（分析纯）、浓硫酸（分析纯）、浓盐酸（分析纯）、消化剂（由FOSS福斯分仪仪器公司配套）、重蒸苯酚（分析纯）、柠檬酸钠（分析纯）、高纯氮气、冷冻剂（冰块）、冰乙酸（分析纯）、胃蛋白酶（上海源叶生物科技有限公司，型号：YY10520），总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.1.3 仪器设备 PB-10型pH计（赛多利斯科学仪器有限公司）、10014133型FOSS消化炉（FOSS TecatorTM Digestor）、KjeltecTM8400自动凯式定氮仪（瑞典福斯分仪仪器公司）、Thermo scientific台式高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技公司）、ALC-210.4分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）、Free zone 7948030冷冻真空干燥机（LABCONCO/美国）、KDB-12型多功能吹氮仪（青岛科迪博电子科技有限公司）、DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）、真空干燥器（艾力特国际贸易有限公司）、L-8900型全自动氨基酸分析仪（HITACHI/日本）、HWS-24型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）、UV-1800紫外分光光度计（岛津）、N-1000旋转蒸发仪（Tokyo Rikakikai Co.， Ltd）。

1.2 方法

1.2.1 龙眼果干蛋白提取的最佳浸泡时间的确定 取40 g龙眼果干，加入140 g蒸馏水，打浆均质后分成6等份，每份25 g，调pH至7.00，分别静置0、2、4、6、8、10 h后过滤，取上清液10 mL定容至50 mL，用自动凯氏定氮仪测定其蛋白质含量，确定龙眼粗蛋白提取的最佳时间，所有试验平行进行3次。

1.2.2 龙眼果干蛋白等电点的确定[15] 取130 g龙眼果干，加入6 500 mL水，打浆均质后分成13等份，浸泡2 h，用1 mol/L的氢氧化钠和2 mol/L盐酸分别调pH至3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9，静置30 min后过滤，滤液定容至50 mL，用自动凯氏定氮仪测定其蛋白质含量，然后进行数据处理，得到龙眼粗蛋白质的等电点。

1.2.3 龙眼果干粗蛋白的提取 取500 g龙眼果干肉，粉碎机粉碎后加入1 600 g蒸馏水，调pH值至8.0，浸泡2 h后抽滤，取滤液调pH至3.0、4.0、5.0，静置2 h后离心（10 000 r/min，10 min），去除上清液，取沉淀物冷冻干燥得粗蛋白粉。

1.2.4 蛋白质、氨基酸含量测定 蛋白质含量的测定参考GB5009.5-2010《食品安全国家标准》中的《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法，氨基酸含量的测定参考GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》的方法。

1.2.5 模拟不同等电点的龙眼果干粗蛋白在体内的消化过程 取稀盐酸（浓盐酸23.4 mL用蒸馏水定容至100 mL）16.4 mL，加水800 mL与胃蛋白酶10 g，摇匀后，加水稀释至1 000 mL得到人工胃液。将预热至37 ℃的人工胃液与不同等电点龙眼粗蛋白按体积（mL） ∶ 质量（g）=1 000 ∶ 1的比例加入试管中，置于37 ℃恒温水浴锅消化30 min。

1.2.6 不同等电点的龙眼果干粗蛋白的总抗氧化能力测定 总抗氧化能力测定采用南京建成生物工程研究所试剂盒，具体操作方法参考试剂盒说明书。

1.3 统计分析

数据处理和统计分析采用Excel软件，结果以均数±标准差（x±s）表示。

2 结果与分析

2.1 龙眼干蛋白的等电点测定

2.1.1 龙眼干蛋白提取最佳时间的测定 不同龙眼干加水打浆后浸泡时间对蛋白质提取含量的影响见图1。从图1中可以看出，0～2 h时，随着浸泡时间的增加，上清液蛋白质含量逐渐增加；当浸泡时间在2 h时，上清液中蛋白质含量达到最高；当浸泡时间大于2 h时，蛋白质含量基本趋于稳定。这说明浸泡2 h后龙眼干中的蛋白质与其他杂质分离效果最好，因此，在后续提取龙眼干蛋白的操作中选定2 h为最佳浸泡时间。

2.1.2 龙眼干蛋白等电点的测定 不同pH对龙眼干蛋白溶解性的影响见图2。由图2可知，pH值在3.0、3.5、4.0、4.5、5.0时，上清液中所测得的蛋白质含量明显低于其他pH值，且含量相差不大。由于龙眼果肉中包含许多不同种类的蛋白，不同组份其等电点也有所不同，因此，可以得出龙眼蛋白沉降较多的5个pH值pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0为龙眼果肉蛋白的等电点。

2.2 不同等电点提取的龙眼干蛋白含量占果肉蛋白总含量的比例测定

由图3可知，不同等电点提取粗蛋白含量相对于龙眼干果肉总蛋白的比例，经冷冻干燥后得到的pI3.0、pI4.0、pI5.0组份粗蛋白质量分别为8.27、15.12、14.15 g，通过凯氏定氮法测得粗蛋白中的蛋白质含量分别为25.64%、23.79%、20.09%。通过换算得到不同等电点蛋白质含量占龙眼果干总蛋白含量的12.69%、21.68%、17.12%，这3部分的蛋白质占龙眼果干总蛋白的51.49%，推测其他48.5%的蛋白质应为其他等电点的蛋白质及不能用碱溶酸沉法提取的其他类型蛋白质。

2.3 不同等电点提取的龙眼干粗蛋白中氨基酸组成

利用氨基酸分析仪测定不同等电点龙眼蛋白中的氨基酸组成，结果见表1。在不同等电点的龙眼蛋白成分测定中，均检测出16种游离氨基酸，其中在pI4.0中，还检测出了其他2个等电点中所没有的半胱氨酸。在检测出的16种氨基酸成分中，谷氨酸的含量在每个等电点蛋白中都是最高的，其在pI3.0、pI4.0、pI5.0 3个等电点中的含量分别为3.17、2.19、1.50 g/100 g。从表1中可以看出，随着等电点的升高，除半胱氨酸外，各种氨基酸的含量依次降低。龙眼等电点蛋白中含有8种人体必需氨基酸，其含量由高到低依次为：亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸，它们占pI3.0、pI4.0、pI5.0等不同等电点氨基酸的比例分别为47.32%、42.91%、45.12%。

2.4 不同等电点提取的龙眼干粗蛋白模拟体内消化试验结果

消化率是机体消化吸收的食物量占食物总摄入量的百分比，是评价食物营养价值的重要指标之一，本实验配制人工胃液胃肠道环境，将不同等电点龙眼蛋白冷冻干燥后按人工胃液体积（mL）∶ 龙眼蛋白质量（g）=1 000 ∶ 1的比例，37 ℃恒温消化30 min以模拟体内消化，评价龙眼蛋白的体外胃消化能力。由表2可知，不同等电点龙眼蛋白在胃液里面的消化能力在消化所需时间和消化完成程度上都有明显不同，它们的消化能力强弱依次为：pI3.0

2.5 不同等电点龙眼干粗蛋白及其消化液总抗氧化能力测定

抗氧化物质能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。在37 ℃时，每分钟每毫克组织蛋白，使反应的吸光度（OD）值，每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位（U/mg Protein）。由图4可知，3个等电点的龙眼蛋白及其消化液均具有一定的总抗氧化能力。pI5.0组份的龙眼粗蛋白具有最强的总抗氧化能力，其次为pI4.0，而pI3.0粗蛋白的总抗氧化能力最小。结合上述消化试验可以发现，消化能力较好的粗蛋白的抗氧化能力较强，这可能由于pI5.0组份粗蛋白在消化前就含有较多的小分子蛋白、多肽片段，使得其消化能力表现较好，而消化能力里较弱的pI3.0和pI4.0组份粗蛋白中的小分子蛋白和多肽片段则相应较少。另外，小分子蛋白和多肽片段中暴露出来的活性位点更多，使得其抗氧化能力要强于大分子蛋白[16]，所以才会出现消化能力较好的粗蛋白组份有较高的抗氧化活性。

对于模拟消化液的抗氧化能力分析结果与粗蛋白不同，pI4.0组份蛋白消化液的总抗氧化能力最强，其次为pI3.0、pI5.0。出现这种结果大致可以归因于粗蛋白中的小分子蛋白和短肽在过度消化过程中会过量分解成氨基酸，一般说来， 肽类的抗氧化能力大于氨基酸[16]，而最容易消化的pI5.0 相比pI3.0、pI4.0组份粗蛋白含有更多的小分子蛋白或者多肽，在消化过程中更快也更容易被分解为氨基酸甚至降解，从而影响其抗氧化活性，使得其总抗氧化最弱，而使得pI3.0和pI4.0组份蛋白经过适量的消化时间后其抗氧化活性较高。

3 讨论与结论

蛋白质提取过程中不同浸泡时间影响粗蛋白的提取量和提取率，本试验结果表明，不同浸泡时间对龙眼蛋白的提取有一定的影响，龙眼果干蛋白浸泡2 h即可达到最大提取，而动物蛋白由于含有大量油脂及结缔组织，提取工艺时间长[17]，说明龙眼蛋白的提取与动物蛋白提取存在一定的差异。对龙眼果干蛋白的研究结果表明，龙眼果干蛋白含有不同的等电点，分别是pI3.0、pI3.5、pI4.0、pI4.5、pI5.0，不同等电点的龙眼果干粗蛋白在氨基酸组成和含量上均有所差异。

通过选取具有代表性的pI3.0、pI4.0 、pI5.0龙眼果干蛋白组份来分析其氨基酸组成及抗氧化性能，结果表明，对不同等电点龙眼粗蛋白的消化程度不同，顺序为pI5.0>pI4.0>pI3.0；且pI5.0组份的龙眼粗蛋白具有最强的总抗氧化能力，其次为pI4.0，而pI3.0粗蛋白总抗氧化能力最小；而在模拟消化液中，pI4.0组份的消化液总抗氧化能力最强，这可能与不同组份蛋白的多肽组成及氨基酸不同有关；同时由于龙眼蛋白的提取方法为“碱溶酸沉”法，在浸泡过程中可能存在色素、多酚多糖等具有活性作用的物质干扰，影响后续的蛋白质抗氧化分析，其不同蛋白组份的活性评价有待于通过动物试验或体外模拟试验进一步研究，或者测定不同等点组份蛋白的多肽组成及分子量分布情况来进一步分析抗氧化情况。此外，经过分析也表明，龙眼蛋白存在不同等电点组份，而且不同组份的蛋白在干制过程中糖基化反应的进展、产物也不同。如能深入分析不同组份在不同干制方法糖基化的产物及其活性，则将有助于揭示龙眼果干功能作用的物质基础。

参考文献

[1] 蔡长河， 唐小浪， 张爱玉，等. 龙眼肉的食疗价值及其开发应用前景[J]. 食品科学， 2002， 23（8）： 328-330.

[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）[M]. 北京： 化学工业出版社， 2005： 65.

[3] Rangkadilok N， Worasuttayangkurn L， Bennett R N， et al. Identification and quantification of polyphenolic compounds in Longan（Euphoria longana Lam.）fruit[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2005， 53（5）： 1 387-1 392.

[4] 易 阳， 张名位， 唐小俊，等. 龙眼多糖的提取分离及其生物活性研究进展[J]. 广东农业科学， 2009， 36（2）： 62-68

[5] 钟名诚，肖 聪. 龙眼肉的研究现状[J]. 中国药业， 2008， 17（16）： 79-80.

[6] 农兴旭， 李 茂. 桂圆肉和蛤蚧提取液的药理作用[J]. 中国中药杂志， 1989， 14（6）： 365-367.

[7] 王慧琴， 白洁尘， 蒋保李， 等. 龙眼肉提取液抗自由基及免疫增强作用的实验研究[J]. 中国老年学杂志， 1994， 14（4）： 227-229.

[8] 黄爱萍， 郑少泉. 龙眼采后低温贮藏过程果肉黄酮和氨基酸含量变化的研究[J]. 福建农业学报， 2010， 25（4）： 475-478.

[9] 谢 立， 陈振德， 陈志良，等. 龙眼肉及其混淆品蛋白多肽高效毛细管电泳法鉴别[J]. 中成药， 2000， 22（6）： 436-437.

[10] Anna J K， Elke P. Contribution of amino acids to strawberry fruit quality and their relevance as stress indicators under NaCl salinity[J]. Food Chemistry， 2008， 111（4）： 642-647.

[11] Anary P M E， Claudete S C， Eny S F， et al. Free amino acid composition of Annona（Annonaceae）fruit species of economic interest[J]. Industrial Crops and Products， 2004， 52（5）： 1 201-1 206.

[12] 戴宏芬， 黄炳雄， 王晓容，等. 18个龙眼品种果肉中氨基酸含量的HPLC测定[J]. 广东农业科学， 2010， 37（10）： 125-128.

[13] Laura J， Mar V， Rosina L. Glycosylation of individual whey proteins by Maillard reaction using dextran of different molecular mass[J]. Food Hydrocolloids， 2007， 21（3）： 433-443.

[14] 卢家成， 孙泽威，李婷琳. 糖基化反应改善大豆抗原蛋白功能特性的研究进展[J]. 大豆科学， 2012， 31（3）： 483-486.

[15] 蔡金星， 刘秀凤， 常学东，等. 蚕豆蛋白质提取分离及其物化性质研究[J]. 食品工业科技， 2007， 28（10）： 142-144.

[16] 任国谱， 余 兵， 李顺灵. 蛋白质及其衍生物的抗氧化性能[J]. 中国油脂， 1997， 22（4）： 47-50.

[17] 裴小平， 唐道邦， 肖更生， 等. 鸡肉蛋白提取工艺研究[J]. 食品科技， 2009， 34（8）： 198-202.