太湖稻区32个水稻品种DNA指纹图谱的构建及遗传多样性分析

鈕玉伟等

摘要[目的]采用SSR标记构建太湖稻区16个常规粳稻品种和16个杂交水稻品种DNA指纹图谱并进行遗传多样性分析。[方法]以筛选出的12对多态性高、稳定性好且在染色体上分布均匀的引物作为核心引物，构建太湖稻区32个主要栽植水稻品种DNA指纹图谱，以NTSYS-PCV2.10软件分析遗传多样性。[结果]12对SSR引物在32份材料中共扩增出了47个等位基因，平均每对引物4.7个，变幅2～6个；12对引物的多态性频率（FP）平均值为0.627，变幅0.266～0.833；以遗传相似系数0.74为阈值可将供试32个水稻品种分成4类。[结论]太湖稻区32个水稻品种遗传多样性相对狭窄。

关键词SSR；遗传多样性；指纹图谱；水稻

中圖分类号S511文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12833-03

Abstract[Objective] The aim of this study was to construct a DNA fingerprinting database of 32 rice cultivars in Taihu lake area， and the genetic diversity was analyzed based on simple sequence repeats（SSR）. [Method] Twelve evenly distributed SSR primer pairs with high polymorphisms and good repeatability were successfully screened to construct the fingerprinting database.[Result] Among the 32 varieties，12 primer pairs had 47 polymorphic locis， and 4.7 polymorphic locis were detected by each SSR primer pair on an average with the range from 2 to 6. Results show that， SSR markers are suitable for using in construction of rice DNA fingerprint with polymorphism differences between the selected varieties. The genetic deversity analyzed by the software of NTSYSpc V2.10 indicated that， 32 rice varieties can be divided into 4 types based on the genetic similarity coefficient of 0.74 threshold. [Conclusion] The genetic diversity of 32 rice cultivars in Taihu lake area is relatively narrow.

Key wordsSSR； Genetic diversity； DNA fingerprint； Rice

随着现代生物技术的发展，以DNA分子标记为基础的品种DNA指纹技术也飞速发展，并开始应用于品种鉴定等领域[1-2]。利用DNA指纹图谱鉴别作物品种具有简单快捷、重复性好、对品种变异鉴别能力灵敏的优点，可直接反映生物的遗传物质在DNA分子水平上的差异，甚至可以区分一些基因组中的微小变异[3]。DNA指纹图谱具有较高的多态性和个体特异性，能够避免外界的环境干扰，不受生长发育时间的制约，快速、稳定及准确鉴定品种（系），包括表型难以鉴定的品种[4]，为作物育种和种子管理提供极大的便利[5]。

已有学者利用微卫星标记（SSR）进行部分地区水稻品种鉴定、指纹库构建、遗传多样性分析[6-9]。陈跃进等[6]选用55对微卫星标记引物对23个水稻品种进行了亲缘关系分析。陈英华等[7]构建了东北地区水稻区试新品种的DNA指纹图谱，刘炜等[8]用37对SSR引物分析了 72个不同生态类型籼粳稻品种的遗传多样性。笔者采用筛选的12对水稻SSR引物，构建了太湖稻区主要栽植的32个水稻品种的DNA 指纹图谱，以期为太湖稻区水稻品种鉴定、遗传资源评价及亲缘关系分析提供理论依据和技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料

32份供试水稻品种为2013年太湖稻区栽植的水稻品种，在常熟市农业科学研究所水稻品种展示区按常规栽培和管理收获，材料编号、品种名称来见表1。

1.2DNA提取

按照CTAB法提取水稻基因组DNA。操作流程：①研钵中加入100 mg水稻叶子样品和700 μl CTAB提取液，充分研磨；②转移混合液至1.5 ml离心管中，65 ℃水浴30 min，每隔5 min振荡混匀；③取出离心管，冷却到室温后8 000 r/min离心2 min；④取出离心管，上清液转移至1.5 ml离心管中，加入等体积氯仿混匀，振荡10 min；⑤12 000 r/min常温离心10 min；⑥转移上清液至1.5 ml离心管中，加等体积异丙醇，混匀后静置10 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清液。70%～75%乙醇漂洗沉淀2次，超净工作台上吹干；⑦加ddH2O 50 μl，沉淀DNA溶解后冰箱保存备用。

1.3PCR扩增及电泳检测

20 μl反应液中包括10×PCR buffer、0.1 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2+、50 ng DNA模版和0.3 μmol/L ESTSSR引物。反应程序为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物选用60 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，36 W电泳3 h。参考王风格等[9]快速银染法，稍加修改如下：50%无水乙醇、2.5%冰醋酸组成的固定液固定5 min；双蒸水快速漂洗1次；0.2%AgNO3溶液染色5 min；1.5%NaOH、0.4%甲醛组成的显影液显影；固定液定影。

1.4数据分析

根据SSR扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，观察稳定且易于辨别的差异性条带，选出具有多态性的引物，记录并进行统计分析，建立其DNA指纹图谱。统计每对引物扩增的条带数，计算多态性频率（frequency of polymorphism，FP）。用Excel的方法计算物种间相似系数（GS）和遗传距离指数（D），根据所得遗传系数矩阵用NTSYS2.1软件进行统计分析并聚类分析。

2结果与分析

2.1品种DNA指纹库的建立

对所有品种的带型进行记录整理后，将12对SSR 引物产生的47个多态位点依次排序，形成一个SSR 数据矩阵（表2），建立32个水稻区试材料的DNA指纹库，以区分供试的每个品种。12对引物中RM 1195能鉴别常粳128，RM489能鉴别南粳46、常优1218、常优2号，RM5414能鉴别嘉33，RM253能鉴别常优4号，RM337能鉴别南农大094240、常优1211、常优115，其余引物无法單独地鉴别某一材料。

3讨论

3.1遗传多样性分析

根据DNA指纹的差异程度进行遗传聚类分析，可以掌握品种间的亲缘关系和遗传距离，以帮助分析品种的特性。该研究所分析的32个水稻品种，12个微卫星标记的多态性频率介于0.266～0.833，平均FP值为0.550。表明所选SSR标记的多态性存在较大差异，部分多态性频率较小，不利于水稻品种的遗传多样性分析和品种鉴定。此外，基于常规水稻品种的标记多态性频率平均值为0516，低于杂交水稻品种的标记多态性频率平均值0.612。该研究检测出的47个等位基因，每个位点的等位基因数目不等，变幅为2～6个，平均4.7，低于相关文献报道中平均标记5. 5个多态性片段，其原因可能与该研究所用材料及SSR引物数较少，遗传多样性相对较低有关，也可能与材料间遗传距离小、所用亲本相近有关。

3.2DNA指纹图谱数据库

该研究利用分子标记技术对江苏太湖稻区32份水稻材料进行了鉴定，聚类分析的结果反映了材料之间在DNA水平上的相似性。供试材料间遗传相似系数都大于0.58，大多数品种显示出较近的遗传距离，遗传基础相对狭窄。部分材料可以单对引物的特征带加以鉴别区分，大部分供试材料必须结合多对引物使用，引物之间依靠彼此所能区分的品种不同，从而组合在一起相互弥补区分开图谱库中的全部品种。聚类分析显示，宁47为常优1216的亲本，常糯1号为苏虞香粳122的亲本，亲缘关系近，不能把它们区别开。聚类分析中，聚类结果有一定的地域分布特点，不同地区的育成品种往往遗传差异较大，不容易聚在一起；同一单位的育成品种遗传差异较小，容易归为一类，如常农粳5、6号、常优2号和常优4号；另外，同一系列水稻品种的遗传差异也较小，容易聚在一起，如部分常优系列品种聚为一小类，但也可能归于其他类群中，这可能是不同品种亲本的遗传差异较大所致。

参考文献

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[2] 李俊芳，张雪原，孙世贤，等.预试品种的真实性和一致性评价[J].玉米科学，2006，14（6）：38-42.

[3] 王凤格，赵久然，戴景瑞.玉米品种DNA指纹数据库构建 的标准化规范[J].分子植物育种，2007，5（1）： 128-132.

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[9] 王风格，赵久然，郭景伦，等.一种改进的玉米SSR标记的PAGE快速银染检测新方法[J].农业生物技术学报，2004，12（5）：606-607.