NaCl预处理对盐胁迫下水稻H2O2含量和过氧化氢酶活力的影响

高宇等

摘要

[目的]通过对水稻苗前期盐的处理后，测定盐胁迫条件下生理指标的变化，确定盐害对水稻的影响。[方法] 测定了一种盐敏感水稻品种（丽江新团黑谷）经过低浓度盐胁迫预处理后在盐害条件下叶片和根中活性氧H2O2的产生和CAT活力。[结果] 50 mmol/L盐胁迫能导致其叶片和根中H2O2含量显著上升，而CAT活力则显著下降。经过低浓度盐（20 mmol/L）预先处理的水稻在盐胁迫下H2O2含量上升幅度则较小，而CAT活力较高。此外，盐胁迫预处理的水稻在盐害条件下生长情况更好，其叶片中叶绿素含量更高。[结论] 活性氧H2O2及其清除酶CAT参与水稻对盐害的应答反应，并且这种预处理能增强水稻抗盐害胁迫能力。

关键词水稻；盐害；过氧化氢；过氧化氢酶；预处理

中图分类号S511文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12814-02

Effects of NaCl Pretreatment on H2O2 Content and Catalase Activity of Rice under Salt Stress

GAO Yu1，2，XU Chunying1，WANG Dan1， JIN Xuehui1* et al

（1.Agricultural College， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing ，Heilongjiang 163319； 2.Heilongjiang Daqing Academy of Science， Daqing， Heilongjiang 163712）

Abstract[Objective]In order to study the effects of salt injury to rice， based on early rice seedlings after pretreatment of salt， the changes of physiological indexes under salt stress were determine. [Method]The salt sensitive rice variety of LTH was pretreated by low concentration of salt stress. And H2O2 content and catalase activity in the leaves and the roots were studied. [Result] 50 mmol/L salt stress could significantly increase H2O2 content in the leaves and the roots， but significantly decrease CAT activity. The rise of H2O2 content of rice pretreated by low concentration of salt stress （20 mmol/L） was low， but that of CAT activity was high. Otherwise， the growth of the rice pretreated by salt stress under the condition of salt stress was good， and chlorophyll content in the leaves was higher. [Conclusion] H2O2 and CAT were engaged in the response reaction of rice to salt stress. And the pretreatment could improve the salt stress resistance of rice.

Key wordsRice； Salt stress； Hydrogen peroxide； Catalase； Pretreatment

在植物生長过程中，其细胞在生理活动中不可避免地产生活性氧分子，如单线态氧、超氧阴离子、过氧化氢以及羟自由基等。这些活性氧会对植物的生物大分子造成伤害，但植物在亿万年进化过程中会产生活性氧自由基防卫系统如抗氧化酶（如清除H2O2的过氧化氢酶）和大分子抗氧化物质（如抗坏血酸等），从而将活性氧自由基的危害降低到最低程度。各种环境胁迫因子如干旱、盐害、强光等都能导致植物细胞中活性氧的过度产生[1]。我国有大量盐碱地，对农作物生长有明显的危害作用，如抑制植物生长，作物产量下降。水稻是一种盐敏感植物，也是我国主要的农作物之一。前人发现，离体水稻叶片在盐害作用下H2O2没有显著上升。此外，对于水稻植物在盐害条件下H2O2是否会上升有不同的结论，如盐敏感水稻H2O2会显著上升，而盐抗性水稻H2O2上升并不明显。然而，在自然界中很少有抗盐水稻品种。这里，笔者对一种盐敏感水稻品种（丽江新团黑谷）用低浓度NaCl预处理后，试图导致其抗盐能力增强，同时研究了后天盐害预处理的水稻在盐害条件下，其活性氧如H2O2产量及其主要清除酶过氧化氢酶（CAT）活性。该研究工作会促进人们对水稻在盐害条件下活性氧代谢产生新的认识。

1材料与方法

1.1植物材料培养及处理

将水稻品种丽江新团黑谷先用浓度0.5%次氯酸钠消毒液处理10 min，然后置于清水中24 h让其发芽。接着，转入营养土中使其生长，光照条件为12 h/12 h，75%湿度下生长。待长到2片叶后，将一部分水稻幼苗用20 mmol/L NaCl预处理24 h，对照为清水处理。然后，将水稻苗重新转入营养土中培养生长48 h。挑选健康和大小一致的2种处理后水稻苗（盐预处理和对照处理的）进行盐害（50 mmol/L NaCl）处理24 h，对照为清水处理。最后，将处理后的水稻苗挑选出来，用自来水轻轻冲洗干净，用于H2O2含量和CAT活力测定。

1.2试验方法

1.2.1叶绿素含量测定。

叶绿素含量测定采用丙酮提取，分光光度法测定[2]。

1.2.2H2O2含量测定及染色。

利用FOX法测定H2O2的含量。其原理是在酸性环境下，氢过氧化物（包括H2O2）能将Fe2+氧化成Fe3+，后者与二甲酚橙反应生成一种紫蓝色的复合物。该复合物在560 nm处有最大吸光值。该方法操作简单，重复性强，灵敏性高[3]。

DAB即二氨基联苯胺，能与H2O2在过氧化物酶催化下生成一种红棕色物质。具体染色步骤为：将叶片浸泡在1 mg/ml DAB溶液中（pH 7.0，DAB事先须溶解在pH 3.8的缓冲液中，低pH环境有利于DAB完全溶解）。然后，置于有光照的温室中8 h。将叶片置于浓度95%的沸腾乙醇中脱色5～10 min，可直接看到红棕色斑点。这就是H2O2与DAB反应的产物[4]。

1.2.3CAT酶抽提及测定。

将植物待测叶片在液氮中研成粉末，用10倍体积的抽提缓冲液抽提。缓冲液配方如下：01 mol/L PBS缓冲液（pH 7.5），内含浓度1%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2。在10 000 g条件下离心20 min，上清液在-20 ℃冰箱中保存，待测。在1 ml反应液（10 mmol/L PBS缓冲液，pH 7.0，10 mmol/L H2O2）中加入适量上述酶抽提液，迅速混匀，在240 nm波长处测定吸光值[5]。蛋白浓度测定采用考马斯亮蓝染色法[6]。

2结果与分析

2.1盐胁迫对水稻叶片叶绿素含量的影响

经过水浸根处理和30 mmol/L NaCl浸根处理[7]，分别设不加100 mmol/L NaCl和加100 mmol/L NaCl处理。由图1可知，盐胁迫处理后，经过水浸根处理，分别加100 mmol/L NaCl叶片（C1）与不加100 mmol/L NaCl（C0）叶片比较，叶片中叶绿素含量明显呈下降趋势。而经过水浸根处理与盐30 mmol/L NaCl浸根处理不加100 mmol/L NaCl处理的叶片（S0）比较，叶片中叶绿素含量依旧呈下降趋势，但是随着盐胁迫的加强以及时间的延长，叶片（S1）中叶绿素含量反而呈上升趋势，甚至超过C0处理叶片叶绿素含量水平。这说明盐胁迫对该品种水稻叶绿素含量有较大的影响。

2.2盐胁迫对水稻叶片中H2O2含量的影响

研究表明，H2O2含量随着NaCl胁迫的加大而增加，但是增加趋势缓慢，30 mmol/L NaCl浸根处理取得的叶片H2O2含量会稍低于水浸根处理加100 mmol/L NaCl叶片，30 mmol/L NaCl浸根处理加100 mmol/L NaCl处理的叶片H2O2含量会稍有增加，但是幅度不大。针对该试验方案测试结果，发现盐胁迫对该品种水稻叶片H2O2含量的影响很小[8]。

2.3盐胁迫对水稻叶片CAT活性的影响

该试验设水浸根处理和30 mmol/L NaCl浸根处理，分别设不加100 mmol/L NaCl和加100 mmol/L NaCl处理，共进行4个处理。由图2可知，CAT活性大小顺序为CS0（水浸根处理不加盐处理）< CS1（水浸根处理加盐处理）< SS0（30 mmol/L NaCl浸根处理不加盐处理）< SS1（30 mmol/L NaCl浸根处理加盐处理）。由此可知，盐胁迫对水稻CAT活性有较大的影响，而当在盐胁迫环境下“锻炼”后，CAT活性受影响不大，说明水稻有一定的耐盐性[9]

3结论与讨论

盐胁迫能干扰植物细胞中活性氧（ROS）产生与清除之间的平衡，导致植物细胞遭受氧化胁迫伤害。在正常条件下，植物细胞中产生的ROS与其清除系统保持这一动态平衡，而当植物受到环境胁迫而使得产生的ROS量超出其清除能力时，就会引起ROS累积产生氧化伤害，导致生物膜脂过氧化、蛋白质变性、DNA链断裂及光合受阻等多种有害现象的出现，使得细胞功能紊乱，机体出现各种氧化损伤毒害。水稻对盐害胁迫相当敏感[10-13]。前人研究显示，抗性水稻品种在盐害作用下叶片组织中H2O2含量并没有显著的改变。然而，盐敏感水稻品种在盐害胁迫下H2O2含量会显著上升[14-16]。此外，离体水稻叶片在盐胁迫下H2O2含量也不会显著上升[17]。研究中，丽江新团黑谷是盐敏感品种，盐害导致其H2O2含量稍有上升。而CAT作为水稻種一种关键的H2O2清除酶，研究中盐害导致其酶活力显著下降[18]。考虑到多数水稻品种是盐敏感品种，而我国又有很大面积的盐碱地，通过非转基因手段获得抗盐能力的水稻研究显得很重要。研究中，通过盐预处理该敏感水稻品种，发现其抗盐能力获得显著增强。这可从生长状态和叶绿素水平获得验证。此外，H2O2产生量相对于对照也稍有上升，而其原因之一可能与其CAT酶活力获得“锻炼”，在盐胁迫条件下能保持较高活力有关。

综上所述，对盐敏感的丽江新团黑谷利用低浓度盐预处理后，该水稻品种在较高盐害条件下其抗性获得显著上升。由盐胁迫诱导的H2O2产生量明显降低，而且能保持较高的CAT酶活力。该研究可为通过体外施加化学试剂增强水稻抗盐能力提供部分理论依据。

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