辣椒CaERF4的全长cDNA克隆及其表达分析

蔡汉阳等

摘 要 通过筛选辣椒均一化cDNA文库，获得一个具有AP2结构域的辣椒CaERF4全长cDNA序列，含有一个编码250个氨基酸序列的开放阅读框，与拟南芥等其它植物ERF蛋白之间有35%～38%的氨基酸序列相似性。该基因在辣椒不同器官中均有不同程度的组成型表达，在根系中表达量略低。此外，还发现CaERF4的转录受到茉莉酸甲酯（MeJA）和乙烯利（ETH）等外源激素处理以及青枯菌接种的诱导，但水杨酸（SA）处理作用不明显，高温处理也可诱导其转录表达增强。说明CaERF4可能在辣椒应答病原菌和高温等逆境胁迫中起调节作用。

关键词 辣椒；乙烯响应因子；转录活性；组织特异性；诱导表达

中图分类号 S641.3 文献标识码 A

Full Length cDNA Cloning and Expressional

Characterization of CaERF4 of Capsicum annuum

CAI Hanyang1，XIAO Zhuoli1，YAN Yan2，GUAN Deyi2，HE Shuilin2*，WU Yang3*

1 College of Life Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002，China

2 College of Crop Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002，China

3 College of Life Science， Jinggangshan University， Jian， Jiangxi 343009，China

Abstract ERF（Ethylene Responsive Factor） is an important plant specific transcription factor family implicated in plant growth， development and response to environmental stresses. However， the structure and function of the major members in this family remain unknown， especially in non model plants such as Capsicum annuum. In the present study， a full length cDNA of putative ERF containing AP2 conservative domain was identified from randomly sequencing of a normalized cDNA library of pepper. This full length cDNA harbors an open reading frame encoding a protein of 250 aa in length sharing 35%-38% sequence identity to ERFs from other plant species. The putative ERF transcription factor was designated as CaERF4 due to its highest sequence identity to AtCRF4. By RT-PCR analysis， CaERF4 exhibited a constitutive transcriptional expression in different organs in pepper plants， and it was also found to be induced to different degree by exogenously applied ETH and MeJA as well as by inoculation of Ralstonia solanacearum and treatment of high temperature stress，but not by exogenous application of SA. These results implied that CaERF4 may play key roles in pepper response to R. solanacearum inoculation and heat stress treatment.

Key worlds Capsicum annuu；EPF；Transcriptional activity；Tissue specificity；Induced expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.011

植物生长发育和对逆境的应答在很大程度上受到转录水平的调节，各种转录因子在其中发挥着十分重要的调节作用。乙烯响应因子（Ethylene Response Factor，ERF）转录因子属于植物AP2/ERF转录因子家族，AP2/ERF类转录因子是植物特有的转录因子，在拟南芥中有146个成员，在水稻中有136个成员[1]，初步的研究结果表明AP2/ERF家族成员与生长发育和应答环境胁迫等生物学过程密切相关，参与植物的生长，花的发育，果实的成熟，叶片的衰老，以及植物应答病原菌，低温，干旱等过程的调控[2-3]。此外还发现AP2/ERF类转录因子与水杨酸、茉莉酸、乙烯等多种信号通路相关[4-7]。例如，在烟草和番茄中过量表达TERF2/LeERF2可提高转基因植物的抗冷性。拟南芥AtERF1通过结合GCC盒激活PR基因表达，从而提高拟南芥对生物胁迫和非生物胁迫的抗性[8-9]。拟南芥过量表达AtERF14可通过上调ERF1、PDF1和Chi等防御反应相关基因提高拟南芥对镰刀菌（Fusarium oxysporum）侵染的抗性[10]。番茄JERFs的表达与ET和 ABA 信号途径相关，参与番茄耐盐、耐旱、耐冷和抗病调控[11]。这些结果显示出ERF家族成员在植物应答逆境胁迫过程中的重要作用。迄今关于ERF的研究大多数集中在拟南芥、水稻、番茄和烟草等少数作物的部分成员，人类对不同植物ERF家族的大多数成员的结构和功能还所知甚少。

辣椒是一种中国重要的蔬菜和工业原料作物，其播种面积达130万hm2，仅次于大白菜，而产值居第一位。然而，辣椒也是一种土传病害多，不耐连作的典型的茄科植物，生产上频繁发生的病害及其它逆境容易导致其产量的降低和品质的劣化，探索其抗逆的分子机制是促进辣椒抗病抗逆遗传改良的重要基础性工作。迄今为止，有关辣椒ERF等转录因子的研究报道还不多。本研究通过辣椒均一化cDNA文库测序，获得一个含有AP2结构域的辣椒ERF基因的全长cDNA，含有保守的ERF和AP2结构域，命名为CaERF4。初步研究表明该基因在辣椒不同器官上具有不同程度的组成型表达，且其转录表达也受到病原菌接种等诱导，表明该基因可能参与辣椒应答病原菌侵染的防御反应。

1 材料与方法

1.1 材料

辣椒品种120#，由福建农林大学作物学院遗传育种实验室提供并由本实验室保存；辣椒均一化文库为本实验室构建并保存。

PrimeScriptTM RT-PCR Kit反转录试剂盒SYBR Green PCR Master Mix Kit（Roche）和RNA提取所用的Trizol均购自大连宝生物TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 CaERF4全长cDNA的获得和序列分析 本实验室构建辣椒叶片均一化cDNA文库，从中任意挑选1 000个单克隆送到华大基因测序公司测序，用blastp进行蛋白质比对和DNAMAN软件对所有的测序结果，从中获得CaERF4基因的全长cDNA序列；并对该目标序列进行进一步的分析和研究。

1.2.2 植物材料的处理 将辣椒种子播种在基质土中，放置在28 ℃的温室中，待萌发长成小苗后，重新移种到10 cm宽的塑料钵中培养，成长到6片叶子（子叶除外）时期。然后挑取大小差不多一致的辣椒苗进行激素、病原菌接种以及高温处理。分别用100 μmol/L乙烯利（ETH）、1 mmol/L水杨酸（SA）、100 μmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）对辣椒小苗进行处理，每个1 h喷晒叶片1次，用水作为对照。分别在处理后0、1、3、6、12、24、48 h时，进行采样，放置液氮中保存，并放置于-80 ℃的冰箱中，用于提取mRNA。用43 ℃作为高温处理，用没有处理正常的28 ℃作为对照，然后在处理后0、1、3、6、12、24、48 h的时间点采用，保存用于提取mRNA。青枯菌接种处理，用本实验室保存的青枯菌，在培养基中培养至OD600=0.8时，用10 mmol/L的MgCl2重悬至OD600=0.8，用无菌的注射器注射辣椒叶片，在处理后0、2、6、12、24、36、48、72、96 h时采样并保存，用于提取mRNA。同时，采取6叶期辣椒幼苗的根、茎、叶以及辣椒开花时的花和绿果放置于-80 ℃的冰箱中，用于提取mRNA。

1.2.3 mRNA的提取及RT-PCR和qPCR分析 采用Trizol法提取辣椒叶片及其根、茎、花和果等组织的总RNA，PrimeScriptTM RT-PCR Kit反转录试剂盒反转录合成单链的cDNA，作为模板，用于RT-PCR和qPCR分析用。设计一对特异性RT-PCR扩增引物F： 5′-TAGATGTAGTGTGTTGTAC GGGGGCTA-3′和R：5′-CTCACAAAGTCCACCGAT

GAATAGACTAC-3′。PCR体系为25 μL：10×Exbuffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，Ex Taq 酶0.2 μL， cDNA模板1 uL，ddH2O 17.3 μL。RT-PCR反应程序为 94 ℃ 4 min； 94 ℃ 1 min； 60 ℃ 45 s； 72 ℃ 1 min；35个循环；72 ℃ 10 min。qPCR分析采用实验室建立和采用体系[12-14]进行，反应体系为10 μL：2×SYBR 5 μL，引物各0.2 μL，模板1 μL，ddH2O 3.6 μL。反应程序为94 ℃ 5 s；94 ℃ 30 s，60 ℃ 34 s，40个循环，重复3次。

2 结果与分析

2.1 CaERF4全长cDNA序列分析

从辣椒叶片均一化cDNA文库测序中获得一个长度为1 545 bp的阳性克隆，其中含有5′端的非编码区399 bp、3′端非编码区393 bp和一个长度为753 bp开放读码框（ORF），其推定蛋白质长度为250个氨基酸残基（图1），分子量为28.3 ku。推定该蛋白质氨基酸序列中具有一个长度为55个氨基酸残基的AP2 结构域（102～156）和一段富含K、R氨基酸的类似核定位信号的碱性结构域。通过NCBI中的BLASTP同源搜索结合DNAMAN软件比对，发现该蛋白质与其它植物的ERF转录因子蛋白具有35%～38%的氨基酸序列同源性（图2～3）。由于与拟南芥AtCRF4的同源性最高，将其命为CaERF4。

2.2 CaERF4在辣椒不同器官中表达分析

提取辣椒成熟植株根、茎、叶、花、果的总RNA，进行CaERF4表达的半定量RT-PCR分析，结果发现CaERF4在叶、花、绿果、根和茎中均具有不同程度的组成型表达，在根中的表达量略低（图4）。

2.3 CaERF4在青枯菌接种、高温及外源激素处理下的表达分析

由图5可知，在喷施SA后CaERF4的转录表达变化不明显；辣椒叶片在喷施ETH 6 h后表达量CaERF4明显上调；MeJA处理后3 h以内，CaERF4的表达量没有明显的变化，但6 h后CaERF4的表达量明显上调，处理后48 h明显下调；辣椒植株高温胁迫下仅胁迫处理6 h CaERF4的转录表达明显升高，其它时间点变化不明显；辣椒叶片在青枯菌接种6 h前CaERF4的表达量没有明显的上调，但接种12 h后明显上调，一直持续到72 h，96 h后又下降到处理前的水平。

3 讨论与结论

乙烯作为植物内源的植物激素，在植物中扮演很重要的作用，如植物生长、发育以及对生物和非生物胁迫的应答[2-3]。乙烯应答因子ERF作为乙烯信号途径中很重要的转录因子，在乙烯介导的植物生长、发育以及对生物和非生物胁迫的应答起重要的作用[4]。本研究所获得的辣椒ERF转录因子阳性克隆含有AP2保守功能域，与已分离和鉴定的其它植物ERF具有较高的同源性，推测该基因应是辣椒ERF家族成员。

基因的表达与基因的功能是密切相关的。本研究表明，CaERF4在辣椒不同的器官中均表现出一定程度的组成型表达。这种组成型表达可能与该基因参与植物生长发育的调控有关，其在不同器官中组成型表达水平的差异的可能生物学意义还有待于进一步深入研究。植物对病害及其它非生物逆境胁迫的抗性一般都需要消耗物质和能量，植物在没遭受到逆境时关闭抗逆反应，而在遭受逆境胁迫时启动抗逆反应，这是在长期的进化过程中形成的一种对物质能量经济有效抗逆策略。因此，与植物抗逆调控有关的基因往往表现出诱导型转录表达的特点。本研究发现CaERF4除了表现出不同程度的组成型表达外，在逆境胁迫青枯菌接种和高温胁迫处理下还表现出诱导型表达，说明该基因可能参与辣椒应答病原菌侵染和耐高温胁迫。有研究表明，SA、JA和ET等内源激素介导的信号通路与植物应答病原菌和高温密切相关[15]，本研究发现CaERF4可不同程度地受到外源SA、JA和ET处理的诱导，表明该蛋白在参与调控辣椒应答青枯菌和高温等逆境胁迫过程可能受到SA、JA和ET信号通路的调节。通过功能获得或功能缺失研究CaERF4在辣椒应答青枯菌侵染和高温胁迫下的作用，可进一步剖析其与SA、JA和ET信号通路的关系将有利于剖析辣椒抗青枯病和耐高温互作的分子机制。

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责任编辑：古小玲