‘四季蜜’龙眼花芽总蛋白质提取方法及双向电泳体系的优化

欧高政 陈清西

摘 要 利用TCA丙酮法、丙酮法、TCA酚抽提法和改良酚抽法等4种方法，提取‘四季蜜龙眼花芽的总蛋白质，在蛋白产量、单向SDS-PAGE和2-DE图谱等方面进行比较，并对IPG胶条种类、蛋白质上样量及等电聚焦条件等进行优化。结果表明：采用改良酚抽法，选用24 cm、pH3～10的胶条，按120 μg上样，在适宜的等电聚焦条件下，可获得背景清晰、重复性好、分辨率高的2-DE图谱，本研究为‘四季蜜龙眼花芽蛋白质组学后续研究奠定了基础。

关键词 ‘四季蜜龙眼；花芽；总蛋白；提取方法；双向电泳

中图分类号 S667.201 文献标识码 A

Method of Total Protein Isolation from Floral Buds of Longan

（Dimocarpus longan Lour. Cv Sijimi）and Optimization

of Two-dimensional Electrophoresis System

OU Gaozheng1，2，CHEN Qingxi1 *

1 College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

2 Fujian Vocational College of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350119， China

Abstract The total protein in the floral buds of Dimocarpus longan Lour. Cv Sijimi was extracted with four methods，namely trichloroacetic acid（TCA）-acetone，acetone，TCA/phenol and improved phenol，and compared by protein production，one-way SDS-PAGE and 2-DE. The sample loading quantity，the gel concentration and the key process of IEF were also optimized. The result showed that the improved phenol extraction protocol was the best method for floral buds. And a high quality 2-DE map with low background was obtained using the following optimized procedure：loading 120 μg protein sample on 24 cm IPG strip with pH3-10. The study built up a good basis for the future proteomics research in D. longan（Lour. Cv Sijimi）.

Key words Dimocarpus longan Lour. Cv Sijimi； Floral buds； Total protein； Extraction method； Two-dimensional electrophoresis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.010

‘四季蜜龙眼一年四季均能自然开花结果，该品种在自然条件下，成花不需低温和干旱条件，花芽分化、开花和座果在高温下仍能正常进行，其特殊的开花习性为研究龙眼周年生产提供了便利。通过双向电泳技术分析‘四季蜜龙眼成花过程蛋白质图谱的差异，寻找与成花相关的蛋白质并进一步分离相关基因，对调控龙眼成花有重要理论意义。但龙眼属于顽拗性植物，芽中含有大量的酚类、多糖及色素等干扰物质，不利于总蛋白质的提取。虽然前人研究龙眼成花逆转时曾对普通龙眼花叶芽进行过提取，但是所用方法不同，效果也不一样[1-2]，因此有必要对‘四季蜜龙眼芽的总蛋白质提取方法和双向电泳体系进行优化，以期为进一步研究龙眼花芽分化相关的蛋白质组学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供试材料于2012年8月采于福建省云霄县源发农场，选择正常挂果的‘四季蜜龙眼成年树，选取新梢基部直径>0.5 cm的顶芽，用经净化处理的镊子将花芽的鳞片去除后置于冰盒中带回实验室，用液氮处理后放入-40 ℃冰箱备用。

1.1.2 主要仪器与试剂 IPG phor III等电聚焦仪、Ettan DALT six中高通量二向垂直电泳系统、Imagescanner II扫描系统均为GE公司产品；DYCZ-24EN垂直电泳仪，为北京六一仪器厂产品；HX-1050恒温循环器，为德天佑公司产品。

固相pH梯度干胶条（IPG干胶条，pH4～7，13 cm、18 cm）、IPG buffer（pH3～10；pH4～7）、Pharmylte、二硫苏糖醇（DTT）和碘乙酰胺（Iodacetamide）均购自GE公司；丙烯酰胺（Acrylamide）、N，N'-甲叉双丙烯酰胺（Bis-acrylamide）、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、CHAPS均购自Amresco公司；Tris-base、溴酚蓝、蛋白Marker、EDTA-2Na、三氯乙酸（TCA）、pH7.8 Tris饱和酚、十二烷基磺酸钠（SDS）、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、过硫酸铵（AP）、TEMED、硫代硫酸钠（Na2S2O3）、无水碳酸钠（Na2CO3）、甘氨酸（Glycine）、牛血清白蛋白（BSA）、考马斯亮蓝R-250/G-250、β-疏基乙醇（β-ME）、琼脂糖等购于上海生工。冰醋酸、丙酮、无水乙醇、无水甲醇、醋酸氨、硝酸银、甲醛等均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 总蛋白质提取方法

（1）TCA/丙酮法。参照赖呈纯等的方法[3]稍加改进。称取1.0 g供试材料，加入液氮研成粉末，移入10 mL离心管中，加入4倍体积预冷的丙酮（含100 g/L TCA，体积分数0.07% β-巯基乙醇），充分涡旋后-20 ℃下静置6 h或过夜，以使蛋白充分沉降，后按方法步骤进行，将沉淀置于-20 ℃冰柜中，使残留的丙酮挥发干净，-20 ℃保存备用。

（2）丙酮法。参照范海延等的方法[4]稍加改进。供试材料研磨采用含0.07% β-巯基乙醇预冷的丙酮制成匀浆，充分涡旋后置于-20 ℃沉降1 h，后按方法进行，最后将沉淀置于-20 ℃冷冻干燥，保存备用。

（3）TCA/酚提法。参照Wang W等[5]的方法稍加改进。供试材料首次所得沉淀用冷丙酮再洗1次，把沉淀转入研钵，室温挥发干丙酮，转入新的离心管，加入1 mL丙酮（含100 g/L TCA，体积分数0.07% β-巯基乙醇）洗涤3次，直至沉淀无色。后按方法步骤进行，最后沉淀-40 ℃保存备用。

（4）改良酚提法。参考Saravanan等[6]方法加以改进。称取1.0 g材料，加入液氮研磨成粉（加入20% PVPP研磨），加入5倍体积的0.07% 2-ME/冷丙酮，振荡涡旋，4 ℃，15 000 g/min离心10 min，重复2次。抽干丙酮，转入新的研磨，再用液氮研磨成更细粉末，加入4 mL SDS缓冲液，涡旋，充分混匀，4 ℃放置30 min（每隔10 min 振荡1次），加入等体积的pH7.8 Tris饱和酚，涡旋振荡，放置-20 ℃ 30 min（每隔10 min振荡一次），4 ℃，15 000 g/min离心10 min，转移上层酚相，加入等体积SDS缓冲液重复抽2次，涡旋充分混匀，4 ℃，15 000 g/min离心10 min，转移上层酚相（分成2份），加入5倍体积0.1 mol/L醋酸氨甲醇溶液，置-20 ℃至少4 h或过夜，4 ℃，15 000 g/min离心15 min，沉淀用5 mL 0.1 mol/L醋酸氨甲醇溶液洗3次，80%冷丙酮洗2次，晾干保存备用。

1.2.2 蛋白质定量 参照Bradford法[7]测定样品中总蛋白质含量。

1.2.3 电泳方法 SDS-PAGE电泳采用Laemm Li的方法[8]，用4%浓缩胶和12.5%分离胶，考马斯亮蓝染色。双向电泳用裂解液[7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%（W/V）CHAPS，2%（V/V）pharmalyte，60 mmol/L DTT（现加）]溶解蛋白，4 ℃，15 000 g/min离心15 min，取上清加入水化液[8 mol/L尿素，2%（W/V）Chaps，1%（V/V）IPG缓冲液，40 mmol/L DTT，2%溴酚蓝]上样。IPG干胶条pH分别为3～10、4～7，长度分别为18 cm、24 cm，水化液与样品终体积分别为340 μL、450 μL，进行等电聚焦，18 cm等电聚焦参数见表1。将聚焦好的IPG胶条用平衡液Ⅰ（100 mg/10 mL DTT）和平衡液Ⅱ（250 mg/10 mL碘乙酰胺）依次平衡15 min。第二向电泳采用12.5% SDS聚丙烯酰胺凝胶。

1.2.4 凝胶染色及图像分析 电泳后的凝胶染色参照郭尧君[9]的银染法。染色后使用Imagescanner II系统进行扫描，并用Image MasterTM 2D Platinum software7.0分析软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法蛋白产量及单向SDS-PAGE电泳比较

‘四季蜜龙眼花芽4种蛋白质提取方法的比较见表2，由表2可知，在4种提取方法中，虽然TCA/丙酮法和丙酮法获得的蛋白质干粉远多于TCA/酚抽提法和改良酚抽法，但在提取所得的蛋白产量上存在显著的差异。改良酚抽法得率最高，为（3.18±0.12）mg/g FW，TCA/酚提法可获得蛋白量为（2.706±0.06）mg/g FW，两者差异不明显，但与TCA/丙酮、丙酮法达极显著差异。因此从蛋白质产量看，样品经过酚抽提效果明显增强。

将提取的蛋白按上样量50 μg进行单向SDS-PAGE电泳（图1），4种方法提取的蛋白经SDS-PAGE分离后条带数目以及染色深浅均有一定的差异，改良酚提法与小量酚提法均得到明显的条带数，其分离效果明显，说明酚提所得的蛋白质质量好；TCA-丙酮法仅得到微弱的条带，可能含有较多的杂质；丙酮法提取的蛋白电泳检测后几乎没有条带。因此，从单项SDS-PAGE电泳来看，酚抽提的效果要优于丙酮沉降。

2.2 不同上样量对双向电泳图谱的影响

上样量的大小影响着2-DE图谱效果（图2）。由于植物中蛋白质表达丰度不同，上样量低就会造成某些低丰度蛋白无法显示，影响蛋白的检测；但是如果上样量过高，又有可能造成斑点的交叉，影响低丰度蛋白的分离，且过高的上样量也会使盐和杂质的含量提高，影响等电聚焦效果。本研究选取蛋白获得量最多、单向SDS-PAGE效果好的改良酚提法进行上样量比对，综合考虑染色方法的灵敏度、前期重复试验的结果，并参考前人的相关研究[10-11]，选取了18 cm pH4～7的IPG胶条，设定了90、100、120、150 μg 4个梯度进行比较，从图2-C中可见，蛋白质点分布均匀，背景清晰，聚焦效果良好，图2-A中蛋白点过少，图2-B中蛋白点有所增加，但相较2-C而言，仍有许多蛋白点未能有效表达，图2-D中背景受到一定的影响，且有些点过表达，干扰了低丰度蛋白的检测。因此认为在‘四季蜜龙眼芽蛋白双向电泳中，选择120 μg上样量可取到良好的效果。

2.3 不同提取方法对2-DE图谱的影响

在确定上样量后，对不同提取方法进行了2-DE图谱比较，结果见图3。在4种提取方法中，TCA/丙酮法能获得少量的蛋白点，丙酮法则仅有极少的点，其结果与单向SDS-PAGE相同，说明单向SDS-PAGE有指示作用，但导致单向SDS-PAGE中丙酮法没有检测到条带的原因可能与蛋白浓度偏低有关。从图3-D可见，改良酚提法的提取效果最好，经过分析软件检测可得到约637个蛋白点，要优于其他3种方法，因此改良酚提法比较有利于‘四季蜜龙眼芽总蛋白的提取。

2.4 不同电泳体系对2-DE图谱的影响

分别采用pH3～10和pH4～7的24 cm IPG胶条对‘四季蜜龙眼花芽蛋白质进行分离，结果表明，采用pH3～10的IPG胶条得到了全范围的蛋白质点，经过Image MasterTM 2D软件分析共得到1 427个蛋白点；而pH4～7的IPG胶条只获得了约819个蛋白点，明显少，且碱性端蛋白质点完全缺失，故要深入进行差异蛋白的分析，宜选用pH3～10的IPG胶条进行下一步研究。

第一向IEF中，聚焦电压是电泳图谱优劣的关键因素之一。如果在设定时间内达不到聚焦电压，则有部分蛋白点无法进入胶条中，也就影响了蛋白点的显示；如果聚焦过度，则背景过深，蛋白点模糊。本研究设定了24 000、32 000、40 000 Vh 3个梯度进行比较，通过Image MasterTM 2D软件分析不同等电聚焦强度下的凝胶图谱，结果表明等电聚焦时间达到32 000 Vh，背景干净，蛋白点清晰，无论对于高丰度和低丰度蛋白都有较好的分离效果，而24 000 Vh时高丰度蛋白无法有效分离，低丰度蛋白则有些未能显现，40 000 Vh时背景偏深，且有些蛋白点出现拖尾或粘连，不利于后面的蛋白质分析，因此等电聚焦选择32 000 Vh有利于24 cm的双向电泳分析（图5）。

通过对聚焦电压的比对、优化，以及研究过程中对整个等电聚焦运行程序的反复试验，得出了较为优化的IEF参数，优化后的电泳参数见表3。

3 讨论与结论

蛋白质样品的制备是双向电泳的关键环节，提取所得蛋白质质量的优劣直接影响到双向电泳的分辨率、重复性，进而影响后续研究的开展，如质谱分析、差异蛋白比对等。TCA/丙酮法作为目前植物组织蛋白质提取最常用的方法，在许多植物组织上都获得了很好的效果，但主要集中在叶片、果皮上[12-16]，而对于种子、胚性愈伤组织、花器官等的效果则相对较弱。本研究中，笔者经过多次重复试验发现，TCA/丙酮法在碱端会产生一个暗色区域，这说明其中含有一些较高浓度的盐离子，这些离子的存在影响了碱性端蛋白质的分辨，不利于后期的研究。丙酮法由于步骤简单，所得干粉中可能含有杂质，影响了蛋白的有效表达，使得IEF中聚焦不完全，从而无法得到相应的点。而TCA/酚提法，从单向SDS-PAGE的效果来看，其提取的完整性较好，而且也能得到较为清晰的图谱，但是可能由于其量较少，导致蛋白数目偏少，许多微量表达的蛋白没法显示出来。改良酚提法在研磨时加入20% PVPP可有效去除花芽中的酚、醌类、色素等物质；并在丙酮抽提后进行二次研磨，可使得所得粉末更细，利于后面非蛋白物质的去除，笔者重复研究发现酚抽提后用SDS缓冲液重复抽提，能提高蛋白纯度，使蛋白质产量相应增加，利于后期的2-DE研究。对比4种提取方法后，结果表明，改良酚抽提法更适合于‘四季蜜龙眼花芽蛋白的提取，蛋白质含量高，质量好，蛋白点能均匀地分布在凝胶上。

等电聚焦运行程序的参数设定对2-D效果影响很大，聚焦不足或过度聚焦都会对2-D图谱造成影响。在过往研究中，人们多数关注上升到8 000 V或10 000 V后的等电聚焦时间[17-18]。而本研究发现，将水化时间从10～12 h延长至15 h，可提高凝胶上的蛋白点数，这可能是由于干胶条在低压下充分泡涨，水化液中的蛋白尽数进入胶条的原因。此外，在进行聚焦程序时，将伏小时数设置到32 000 Vh，可使每个蛋白点清晰，所得2-D图谱分离效果较为理想。

通过反复的试验比较，优化了‘四季蜜龙眼芽总蛋白提取及双向电泳技术：取1.0 g芽体材料，运用改良酚提法提取，以120 μg为上样量，选择pH3～10长度24 cm的胶条，运用如表3的参数进行双向电泳，可获得清晰的蛋白图谱，对于‘四季蜜龙眼花芽分化机理的研究具有重要意义。

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责任编辑：叶庆亮