巴西橡胶树HbDRM的克隆与表达分析

汪晗等

摘 要 运用PCR和RACE技术从巴西橡胶树中克隆出了一个域重排甲基转移酶（Domains rearranged methyltransferase， DRM）基因（HbDRM）。HbDRM全长为2 245 bp，含有1 917 bp的阅读框，145 bp的 5′-UTR和176 bp 3′-UTR，编码638个氨基酸，分子量为71.39 ku，等电点为4.90。HbDRM的氨基酸序列与可可、葡萄、黄瓜、鹰嘴豆、番茄、拟南芥DRM家族成员的同源性分别为77%、74%、72%、67%、64%和52%。定量RT-PCR分析表明HbDRM在巴西橡胶树的根、树皮、叶、花、胶乳、胚和愈伤组织中均有表达，其中在花和愈伤组织中表达量较高，在胶乳中表达量最低，此外HbDRM在橡胶树自根幼态无性系的胶乳中表达比其供体胶乳中的表达低。HbDRM的克隆和表达分析为下一步研究HbDRM在巴西橡胶树自根幼态无性系高产中的作用打下基础。

关键词 巴西橡胶树；域重排甲基转移酶；DNA甲基化；自根幼态无性系；克隆与表达

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract The full-length cDNA encoding a domains rearranged methyltransferase， designated HbDRM，was isolated from rubber tree by using PCR and RACE techniques. HbDRM was 2 245 bp in length and contained an open reading frame of 1917 bp. Sequence analysis revealed that the ORF of HbDRM encoded 638 amino acid residues with apredicted molecular mass of 71.39 ku. The deduced amino acid sequences of HbDRM showed high identities of 77%， 74%， 72%， 67%， 64% and 52% to those of the DRM from Theobroma cacao， Cucumis sativus， Cicer arietinum， Solanum lycopersicum and Arabidopsis thaliana. HbDRM expressed at different levels with the highest transcription in the flowers， followed by the callus and leaves. HbDRM transcript expressed at different levels with the lower in self-rooting juvenile clones than in their donor clones. The present study perhaps contributes towards an understanding of the molecular mechanism underlying high yielding in self-rooting juvenile clones.

Key words Hevea brasiliensis；Domains rearranged methyltransferase；DNA methylation；Self-rooting juvenile；Cloning and expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.016

表观遗传是指不因DNA序列的变化而形成的基因功能的改变，这种改变又可随细胞的有丝分裂和/或减数分裂遗传下去的现象[1]。表观遗传的分子机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质改型和小RNA干扰等。甲基化是一种主要表观遗传修饰形式，是调节基因功能的重要手段[2]。通过一系列DNA甲基转移酶来建立和维持DNA甲基化模式[3]。在植物DNA的甲基化过程中，目前发现至少有3类在结构和功能上不同的胞嘧啶甲基转移酶[3-5]：第1类是MET1（Methyltransferase， MET），甲基转移酶家族，其主要功能是作为维持DNA的甲基化，也可能在DNA重新甲基化中起作用[6-7]；第2类是染色质甲基化酶（Chromomethylase， CMT），是植物特有的一种甲基化酶，可以选择性的对异染色质区域DNA甲基化[8]；第3类则是域重排甲基转移酶（Domains Rearranged Methyltransferase， DRM），与哺乳动物的从头甲基转移酶（de novo methyltransferase 3， DNMT3）相似，主要参与RNA指导的DNA甲基化[9-11]。

天然橡胶是一种重要的工业原料，巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）作为一种重要的产胶植物，是天然橡胶主要的商业来源，是热带地区重要的经济作物。巴西橡胶树自根幼态无性系是以橡胶树花药为外植体经过组织培养得到的再生植株[12-13]。大量的对比实验表明同一品系的自根幼态无性系橡胶树的产量比相应的供体（老态无性系）可提高20%～50%[13-16]，但对橡胶树自根幼态无性系高产的机制方面的研究目前还很少，归纳起来自根幼态无性系高产的构成因子主要有：较快的生长速度、较多的乳管列数目、较好的排胶和产胶生理特性[14]。Yuan等[17]对第5割年自根幼态无性系及其供体树树皮结构和生物特性进行研究，发现幼态无性系的茎围增大、乳管层数增多、干胶含量提高、堵塞指数和黄色体破裂指数变低、胶乳糖和无机磷含量提高。王泽云等[18]认为自根幼态无性系的胶乳再生能力和排胶性能均显著优于老态无性系是高产的生理基础，而这种差异的实质是相关基因表达在时空和强度上的差异。李辉亮[19]证实了橡胶树自根幼态无性系与老态无性系基因组DNA之间存在甲基化多态性的差异，此外发现在自根幼态无性系和老态无性系的胶乳中存在基因和蛋白的差异表达[20-25]，但造成差异的根本原因还不清楚。橡胶树自根幼态无性系与供体的遗传背景没有差异，也就是说所含遗传物质DNA在碱基序列上应该是相同的，因此自根幼态无性系与其供体之间所表现出的差异，很可能与表观遗传修饰中的DNA甲基化相关。

为了研究橡胶树自根幼态无性系高产与DNA甲基化的关系，本课题组对橡胶树的3类胞嘧啶甲基转移酶基因进行了相关的研究。本研究将报道巴西橡胶树DRM基因（HbDRM）的克隆和表达，该结果为进一步研究橡胶树自根幼态无性系高产与DNA甲基化的关系打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 试验选用巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）海垦2号自根幼态无性系及其供体老态无性系，用于差异表的幼态无性系和老态无性系的胶乳采于同一时间，采自同一试验田的生长状态良好，树龄相同的植株。胶乳的采样按照参考文献[26]进行，用液氮收集。叶片、花、根、树皮、芽、胚和愈伤组织采集后用液氮研磨后最终于-70 ℃保存待用。

1.1.2 质粒、菌种及试剂 Taq DNA Polymerase购于Fermentas公司，T4-DNA连接酶、RNA PCR（AMV）Ver.3.0、5′和3′-full RACE Core Set购自TaKaRa公司。IPTG、X-gal、dNTPs购于Promega 公司。E.coli DH5α菌株由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 橡胶树胶乳、叶片、花、根、树、芽、胚和愈伤组织的RNA提取参照按照参考文献[27]的方法进行。

1.2.2 HbDRM的5′和3′RACE扩增 用于5′和3′RACE扩增的cDNA的合成按5′和3′full RACE Core Set（TaKaRa 公司）试剂盒说明书进行。根据实验室获得的HbDRM片段序列设计5′和3′RACE引物用于5′和3′RACE扩增。引物分别为5P1：5′-C

CATCATAATCTGAAGACCAGTGATCAG-3′；5P2：5′-CCATTTTCCTGAATTGCTTCAGCAACC-3′。3P1：5′-TGCCGTAAATGGAATCTGGTATGGGTG-3′；3P2：5′-GCTTTTGGGTTTCCCTAGGAACCATAC-3′。5′和3′RACE扩增按照5′和3′-full RACE Core Set试剂盒说明书进行。

1.2.3 HbDRM阅读框序列的PCR扩增 利用DNAMAN软件对HbDRM片段、3′-RACE和5′-RACE获得的片段拼接，根据拼接结果设计引物扩增HbDRM阅读框序列。引物为F1：5′-ATGGATG

GAGATTCGTTTTGTG-3′；R1：5′-TCAATTTCTA GTCATTATACACT-3′。PCR反应体系，94 ℃预变性3 min后，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 35 s，32个循环，再继续延伸10 min。PCR产物的克隆按分子克隆实验指南的方法进行，测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成[27]。

1.2.4 HbDRM的同源性分析和进化树构建 利用DNAMAN软件分析HbDRM蛋白与其它植物的DRM家族同源性和进化树构建。

1.2.5 HbDRM荧光定量分析 荧光定量采用SYBR Premix Ex TaqⅡ，以HbACT基因为内参对照。用于qPCR的引物 qF：5′-GGTGGGAGTCCAT

GCAATAATC-3′；qR：5′-CCAAGTCTAGAATGCG ACAGAAAT-3′。actinF：5′-CAGTGGTCGACAACTG

GTAT-3′；actinR：5′-ATCCTCCAATCCAGACACT GT-3′。反应条件为开始在95 ℃预变性 30 s然后按95 ℃ 5 s、 60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s 进行35个循环。基因的相对表达量按BIO-RAD CFX96荧光定量仪使用说明进行分析。

2 结果与分析

2.1 HbDRM的克隆

通过对其它植物中的DRM的同源比对分析，获得了DRM家族保守结构域。根据保守结构域设计简并引物通过PCR获得了橡胶树DRM基因的片段，根据该片段设计RACE引物，通过3′-RACE和5′-RACE技术分别得到一个1 161 bp的片段和一个919 bp的片段。利用DNAMAN软件对橡胶树DRM基因片段、3′-RACE和5′-RACE获得的片段拼接，得到长2 245 bp的序列（命名为HbDRM）。该序列含有1 917 bp的阅读框架，此外有145 bp的5′非编码区和176 bp的3′非编码区，在3′端非编码区存在一个15个碱基的polyA尾（图1）。根据拼接结果设计特异引物，对HbDRM的阅读框架进行PCR扩增，测序结果与拼接结果完全一致，表明拼接结果正确。

2.2 HbDRM生物信息学分析

将推导的HbDRM蛋白序列进行BLASTp分析，发现HbDRM蛋白与可可（Theobroma cacao）、葡萄（Vitis vinifera）、黄瓜（Cucumis sativus）、鹰嘴豆（Cicer arie-tinum）、番茄（Solanum lycopersicum）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）等物种的DRM家族成员具有较高的同源性，分别为77%、74%、72%、67%、64%和52%（图2）。进一步将HbDRM蛋白与其它植物的DRM家族成员进行进化树分析，发现HbDRM与可可的DRM亲缘关系最近（图3）。

2.3 HbDRM的组织特异性表达

为分析HbDRM的组织表达特性，对HbDRM在橡胶树的根、皮、花、叶、胶乳、胚和愈伤组织的表达进行了定量PCR分析。结果表明HbDRM在所测试的组织中均有表达，其中在花和愈伤组织中表达量相对较高，在胶乳中表达量最低（图4）。

2.4 HbDRM在自根幼态无性系与其供体胶乳的差异表达

乳管是天然橡胶合成的场所，胶乳实质上是乳管细胞的细胞质。为了分析自根幼态无性系与其供体乳管细胞中HbDRM的表达是否存在差异，对HbDRM在自根幼态无性系与其供体胶乳的表达进行了定量PCR分析。结果表明HbDRM在自根幼态无性系的表达比其供体胶乳的表达低（图5）。

3 讨论

DRM基因已经从拟南芥、水稻和烟草等植物中克隆，并进行了相关分析[28-31]，但是到目前为止还未见橡胶树DRM基因的研究报道。本研究首次克隆了橡胶树中DRM基因HbDRM，对其编码的氨基酸与其它植物的DRM的同源性和分子进化进行分析，推导HbDRM是一种与植物DNA甲基化相关的域重排甲基转移酶。

DNA甲基化可调控特定的内源基因表达，而植物启动子区的DNA甲基化通常抑制转录[1，4]。域重排甲基转移酶DRM在RNA指导的DNA甲基化中起重要作用[9-11]。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达，不同组织的基因是选择性表达的，意味不同组织基因甲基化状态是不同的。本研究发现HbDRM在不同组织中差异表达，表明不同组织中DNA甲基化水平存在差异。此外HbDRM在自根幼态无性系的表达比其供体胶乳的表达低，可能造成自根幼态无性系和供体乳管细胞中DNA甲基化的差异，使得自根幼态无性系和供体乳管细胞中基因的表达出现差异，这一结果进一步支持李辉亮[19]提出的DNA甲基化修饰是自根幼态无性系与其供体差异产生的重要原因的推断。目前还不清楚HbDRM在巴西橡胶树自根幼态无性系高产中的作用，HbDRM基因的克隆和表达分析为下一步研究HbDRM在巴西橡胶树自根幼态无性系高产中的作用打下基础。

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