橡胶树产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树中表达模式分析

摘 要 橡胶树死皮（Tapping Panel Dryness，TPD）是天然橡胶单产提高的主要限制因子之一，给中国橡胶种植业带来巨大经济损失。本文利用RT-PCR技术分析14个产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树树皮中表达模式。研究结果表明，有8个基因在健康橡胶树树皮中上调表达，其分别是法尼基焦磷酸合酶、小橡胶粒子蛋白、橡胶素、蔗糖转运蛋白5、橡胶延伸因子、几丁质酶、HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合成酶，有4个基因在死皮橡胶树树皮中上调表达，他们分别是橡胶转移酶、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶、蔗糖转运蛋白2a和β-1，3-葡聚糖酶；另外，蔗糖转运蛋白2b和蔗糖转运蛋白1表达模式没有发生变化。此结果为深入揭示橡胶树死皮发生分子机制提供新观点。

关键词 橡胶树；死皮；产排胶相关基因

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract Tapping panel dryness（TPD）is one of key limiting factors for increasing the yield of natural rubber， and it causes serious economic loss to the rubber production in China. In this study， the expression profiles of fourteen genes related to rubber biosynthesis and flow were analyzed between healthy and TPD rubber tree barks. Eight genes， such as farnesyl-diphosphate synthase， small rubber particle protein， hevein， sucrose transporter 5， rubber elongation factor， chitinase， HMG-CoA reductase and HMG-CoA synthase， were up-regulated in barks of healthy rubber tree； four genes including cis-Prenyl transferase， geranylgeranyl diphosphate synthase， sucrose transporter 2a and β-1，3-glucanase were up-regulated in barks of TPD rubber tree； In addition， the expression patterns of sucrose transporter 2b and sucrose transporter 1 were not changed between healthy and TPD rubber trees. The results provided new insights into the molecular mechanism underlying TPD in rubber tree.

Key words Rubber trees；Tapping panel dryness；Rubber biosynthesis and flow-related genes

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.015

对橡胶树死皮的报道最早见于巴西，1905年出现在亚洲，死皮分为坏死性和非坏死性2种类型[1]。坏死性死皮特征是乳管及其周围组织衰老，内皮褐化，这种症状可迅速蔓延至整个割面，严重时可扩展至对面的非割面。该类型死皮发生很少，对天然橡胶生产不构成威胁，业内所提的橡胶树死皮并不把此种类型包含在内。

非坏死性死皮又称割面干涸（TPD），已被公认为是一种由伤害（割胶）和乙烯刺激引起的生理综合症[1-3]。TPD的特征是树皮组织和细胞学变化较小，但乳管代谢严重紊乱。一旦死皮发生，橡胶树割线局部或全部乳管堵塞，排胶大量减少甚至停排。开割橡胶树的产胶和排胶之间是一个双向反馈系统，但在强割、强乙烯刺激或两者相结合割胶的情况下，这一系统的动态平衡会被打破，系统即维持产胶向排胶的单向性，结果产生过度排胶现象，从而引起乳管细胞原位自毁而死皮[4]。

Sookmark等[5]采用2-DE方法，在橡胶树胶乳中发现3个蛋白可能与死皮相关，经鉴定其中2个蛋白分别为橡胶延长因子（REF）和小橡胶粒子蛋白（SRPP），这2个蛋白都与橡胶生物合成相关。闫洁等[6]采用2-DE和质谱技术鉴定到产排胶相关蛋白在死皮和健康橡胶树胶乳中差异表达。与死皮相关蛋白差异表达结果一致，Venkatachalam等[7]和Li等[8]都发现产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树胶乳中也存在表达差异。李德军等[9]和覃碧等[10]利用橡胶树芯片技术分别在树皮和胶乳中鉴定死皮相关基因，均发现产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树中存在差异表达，以上研究结果说明死皮可能与橡胶树产胶和排胶密切相关。

乳管系统是橡胶树体内合成和贮存胶乳的场所，其遍布于橡胶树的各个器官中，而与采胶生产直接相关的是茎干上树皮中的乳管。尽管有产排胶相关基因和蛋白在死皮和健康橡胶树中存在表达差异的报道，但目前仍无系统研究产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树中的表达模式。橡胶树产排胶相关基因克隆、表达分析及功能研究已有一些报道[11-21]，这些研究为系统分析产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树中的表达模式提供了可能。本研究以PR107为研究材料，系统分析产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树树皮中的表达模式，研究结果为进一步揭示橡胶树死皮发生机制提供新观点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）品种PR107取自中国热带农业科学院实验农场七队。

1.1.2 试验试剂 2×Taq PCR Master Mix聚合酶购自北京天根公司，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司。

1.1.3 仪器设备 PCR扩增实验使用Bio-Rad公司C1000进行。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 橡胶树品种PR107于1985年定植，1992年开割，采用4 d一刀，1.0%乙烯刺激。为保持条件一致，死皮发生后仍采用与健康橡胶树相同的割制，选取2级死皮和健康橡胶树为实验材料，各选取5株生长一致的死皮、健康橡胶树， 采集树皮后立即用0.1% DEPC处理过的蒸馏水洗净胶乳并用灭菌的滤纸吸干。分别将5株死皮、健康橡胶树树皮等量混合， 获得死皮、健康橡胶树树皮材料， 然后放入液氮中快速冷冻用于总RNA提取。

1.2.2 橡胶树胶乳总RNA提取 胶乳总RNA提取参照Venkatachalam等[22]发表的方法进行，利用DNase I去除RNA中残留的少量DNA。用分光光度计定量，并用甲醛变性胶电泳检测提取的RNA质量。

1.2.3 橡胶树产排胶相关基因表达模式分析 以橡胶树产排胶相关基因为研究对象，用橡胶树18S rRNA为内参，采用RT-PCR方法分析产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树中的表达模式。根据已报道橡胶树产排胶相关基因序列设计引物，为提高扩增产物特异性，扩增区段不包含蛋白保守结构域区，选取的产排胶相关基因及其RT-PCR引物信息见表1，引物合成委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成。cDNA第一链合成按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行。以反转录cDNA作为RT-PCR反应的模板，反应体系为：cDNA 1 μL，上游和下游引物各（10 μmol/L）0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（25 mmol/L）0.5 μL，Taq 酶（2 U）0.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃（根据不同基因有所调整）40 s；72 ℃ 40 s，循环28次；72 ℃延伸7 min。PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 巴西橡胶树树皮总RNA质量检测

在RT-PCR分析基因表达模式中， RNA的质量直接影响实验结果。提取的死皮和健康橡胶树树皮总RNA电泳检测如图1所示， RNA电泳条带清晰而完整， 基本无降解现象。28S rRNA比18S rRNA条带亮度大于1 ∶ 1， 死皮和健康橡胶树总RNA的A260/A280分别为1.98和1.85。以上结果表明RNA样品在纯度及完整性上都符合实验要求， 可用于后续产排胶相关基因RT-PCR分析实验。

2.2 巴西橡胶树产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树树皮中表达模式分析

14个产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树树皮中的表达模式如图2所示，与死皮橡胶树树皮相比，在14个产排胶相关基因中，有8个基因在健康橡胶树树皮中上调表达，其分别是法尼基焦磷酸合酶、SRPP、橡胶素、蔗糖转运蛋白5、REF、几丁质酶、HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合成酶，以上基因除几丁质酶和橡胶素外，其余均为产胶相关基因（图2和表1）；与健康橡胶树树皮相比，有4个基因在死皮橡胶树树皮中上调表达，他们分别是橡胶转移酶、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶、蔗糖转运蛋白2a和β-1，3-葡聚糖酶，以上基因除β-1，3-葡聚糖酶外，其他均为产胶相关基因 （图2和表1）；另外，有2个基因在死皮橡胶树树皮中表达没有发生变化，他们分别是蔗糖转运蛋白2b和蔗糖转运蛋白1，以上2个基因都是产胶相关基因（图2和表1）。

3 讨论与结论

橡胶树死皮是限制橡胶树单产提高的主要因子。目前，中国死皮累计发生率在20%～40%，严重地区在40%以上。随着高产无性系和乙烯利刺激技术的推广，死皮发生率和严重程度呈逐年上升趋势。一旦发生死皮，橡胶树将因停止排胶而减产。此外，死皮树因停割长势旺盛，与健康树争夺阳光、养分和水分中处于优势，间接导致周围健康树单产持续下降。

乳管系统是橡胶树体内合成和贮存胶乳的场所， 乳管存在于橡胶树的各个器官， 茎干上树皮中的乳管与胶乳收获直接相关。与健康橡胶树相比， 死皮树树皮在组织学和细胞学上都会发生明显变化， 最终导致橡胶树部分或全部割线不能正常排胶[23]。尽管橡胶树树皮与产排胶和死皮密切相关， 但以前对死皮的研究多集中在胶乳上， 仅李德军等[9]用树皮为材料，利用芯片技术大规模鉴定死皮相关基因。

本研究以死皮和健康橡胶树PR107树皮为材料，首次分析了14个产排胶相关基因在两者中的表达模式。在本研究分析的14个产排胶相关基因中，7个在前人的研究中有所报道。Li等[8]以热研8-79胶乳为材料，用SSH方法鉴定到小橡胶粒子蛋白和橡胶延伸因子在健康树胶乳中上调表达；李德军等[9]以热研7-33-97树皮为实验材料，利用橡胶树oligo芯片技术发现橡胶延伸因子和几丁质酶在死皮橡胶树树皮中下调表达；尽管本研究与Li等[8]研究所用橡胶树品种和组织及李德军等[9]研究所用橡胶树品种不同，但以上2个研究结果均与本研究一致。此外，Venkatachalam等[7]研究结果表明几丁质酶、橡胶素和HMG辅酶A合成酶在死皮橡胶树胶乳中上调表达，Li等[8]发现橡胶素和蔗糖转运蛋白1在死皮橡胶树胶乳中上调表达，覃碧等[11]发现橡胶转移酶在健康树胶乳中上调表达，而HMG辅酶A合成酶在死皮橡胶树胶乳中上调表达，以上3个实验的研究结果均与本研究相反。Venkatachalam等[7]、Li等[8]和覃碧等[10]分别以RRII105、热研8-79和热研7-33-97胶乳为研究材料，本研究则以PR107树皮为材料，推测不同橡胶树品种和不同组织可能是导致以上研究结果不一致的原因。Dian等[24]研究表明橡胶树死皮是一个长期而往复的过程，三级死皮树可能向健康橡胶树发展，也可能向更严重的五级死皮树发展。尽管以上实验都用死皮橡胶树为研究材料，但它们的死皮程度和发展方向可能不同，以上原因也可能导本研究结果与前人研究结果不一致。在死皮相关蛋白研究方面，Sookmark等[5]采用2-DE方法，在橡胶树胶乳中发现3个蛋白可能与死皮相关，经鉴定2个蛋白REF和SRPP在死皮橡胶树胶乳中上调表达。闫洁等[6]采用2-DE和质谱技术鉴定到REF、β-1，3-葡聚糖酶、橡胶素和SRPP在死皮和健康橡胶树胶乳中差异表达，其中β-1，3-葡聚糖酶、橡胶素和SRPP参与乳管伤口阻塞，与橡胶树排胶相关[15]。

目前，死皮相关基因和蛋白的鉴定和分析多以胶乳为材料，以树皮为研究材料相对较少。另外，研究采用的橡胶树品种、割龄、割制和种植环境也不尽相同，这些因素都会对基因的表达模式产生影响，使不同材料、割龄、割制和种植环境的研究结果之间比较较为困难，但各研究结果均表明产排胶相关基因和蛋白在死皮和健康橡胶树中表达模式存在差异，说明橡胶树死皮发生和发展与产排胶相关基因和蛋白相关。鉴于橡胶树死皮的复杂性及研究材料和方法等不同对研究结果产生的影响，应采用不同材料和方法研究橡胶树死皮，对不同研究材料和方法获得结果的共性和差异进行系统分析则更易于发现死皮的本质所在。橡胶树产量由产胶和排胶能力2个方面共同决定，产排胶相关基因的表达变化必然会影响橡胶树产量。产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树树皮中的表达模式显示死皮发生与产胶和排胶都有关，因而应从产胶和排胶2个方面进行深入研究以揭示橡胶树死皮发生机制。

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