水稻OsPIN1a基因体外表达及蛋白磷酸化活性位点分析

王尉等

摘 要 输出载体OsPIN1a是水稻PIN-FORMED（PIN）的家族成员之一，参与调节生长素在植物组织中的不均衡分布。然而，OsPIN1a蛋白的功能结构域如何调节激素的极性运输仍需进一步探讨。本研究拟以日本晴水稻为材料，利用OsPIN1a基因的非编码区设计引物，特异地克隆目的基因，并借助Quickchange XL site-directed mutagenesis技术分别构建单突变[pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala）和pET30-OsPIN1a（Ser254/Ala）]及双突变[pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala和Ser254/Ala）]表达载体，通过体外蛋白表达和磷酸化活性分析，明确了OsPIN1a蛋白水解结构域中Ser-233和Ser-254是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PINOID，PID）的磷酸化活性位点，此结果为进一步研究生长素的极性运输机制提供参考。

关键词 水稻；OsPIN1a；蛋白表达；磷酸化

中图分类号 S511；Q78 文献标识码 A

Expression in vitro of OsPIN1a Gene and

Analysis of Phosphorylation Sites

WANG Wei1，2， GUO Ning1， XU Mingzhao1， TIAN Haiyan2， SHI Shengyou2*

1 School of Life Sciences， Anhui Agricultural University， Hefei，Anhui 230036， China

2 South Subtropical Crop Research Institute， Chinese Academy of Tropical

Agricultural Sciences， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract As one of PIN-FORMED（PIN）efflux carriers， OsPIN1a is involved in regulating auxin distributions in plant tissues. However， how these functional sites of OsPIN1a regulate hormone distribution still need to be further analyzed. In our study， OsPIN1a gene was isolated from Oryza sativa L. cv. Nipponbare using the specific primers， designed according to untranslated regions. To explore the phosphorylation sites of OsPIN1a in proteolytic structures， the expression vectors of single mutation[pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala） and pET30-OsPIN1a（Ser254/Ala）]and double mutation[pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala and Ser254/Ala）]were constructed by quickchange XL site-directed mutagenesis technique， respectively. OsPIN1a was expressed and analyzed by the expression system in vitro. Two phosphorylation sites of Ser-233 and Ser-254 can be phosphorylated by a serine-threonine protein kinase（PINOID， PID）. The results provide a reference for further studying the mechanism of auxin polar transport.

Key words Rice；OsPIN1a；Protein expression；Phosphorylation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.014

高等植物的生长发育受到植物激素的精确调控。生长素在茎尖、幼叶和根等组织器官中合成后，通过输出载体（PIN-FORMED，PIN）、输入载体（AUXIN RESISTANT1/LIKE AUX1，AUX1/LAX）及转运蛋白（P-GLYCOPROTEIN，PGP/ABCB）极性运输到植株的不同部位[1-5]，不仅参与了植物的生理代谢过程，而且与根的向光性密切相关[6-7]。

拟南芥AtPIN家族包含8个PIN基因，AtPIN1、2、3、4、7属于膜蛋白，而AtPIN5、6、8位于内质网上，这些蛋白可与AUX1及转运蛋白协同作用调节生长素的极性运输，导致激素在组织中的不均衡分布，影响根的伸长和向地性等特性[8-9]。在水稻中，至少存在12个编码OsPIN家族基因（OsPIN1a-d、2、5a-c、 8、 9、 10a-b）， 分别位于不同的染色体上[4]。OsPIN蛋白包含两个疏水区（功能结构域）和一个亲水区，且每个疏水区有5次跨膜折叠[10]。然而，多基因家族的单个基因突变并不易引起植物形态的改变或功能的缺陷，尤其是水稻的OsPIN1包括a、b、c、d 等4个同源蛋白，具有较高的同源性，仅有几个氨基酸的差异性[4]。因此，特异地分离同源基因，对明确其各自的功能显得尤为重要。

研究表明，PIN蛋白可逆的磷酸化活性对调节生长素极性运输起着关键作用，而这一过程需要丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINOID（PID）和PP2A磷酸化酶的共同参与[11]。蛋白激酶抑制剂可阻碍拟南芥AtPIN1中TPRXS（N/S）结构域磷酸化位点的活性，进而影响生长素的极性运输[12-13]。为探讨水稻OsPIN1a蛋白如何调节生长素的极性运输，本实验通过OsPIN1a克隆、体外蛋白表达及功能活性位点分析，明确了OsPIN1a亲水区的磷酸化位点，为进一步研究生长素的极性运输机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

将在湿润滤纸上萌发后的水稻（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）秧苗移置在光照培养箱中进行培养（30 ℃，16 h光/8 h黑暗）。两周后，选取长势较好的植株材料置于-70 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 水稻植株总RNA的分离与cDNA合成 用RNAiso Plus（Takara）提取水稻植株中的总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计用于检测RNA的质量。一链cDNA的合成参照PrimeScript Reverse Transcriptase（TaKaRa）使用说明进行。

1.2.2 OsPIN1a引物设计及PCR扩增 根据GenBank中所报道的水稻OsPIN1a基因（GenBank登录号为BR000827）两端非编码区序列设计特异引物（上游引物：GAAGTCGTGGTTTTCTTGGCTGC，

下游引物：GCAAACATGACGACCCTCACCT），以高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶（Takara）进行目的基因PCR扩增。反应体系为：cDNA模板2 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，2×GC buffer 25 μL，10 mmol/L上、下游引物各2 μL，2.5 U/μL PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O补足至50 μL。扩增程序为：85 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环，最后72 ℃总延伸10 min。将上述PCR产物回收并连入pMD18-T载体（TaKaRa）中，通过蓝白斑和酶切鉴定筛选阳性克隆，后进行测序鉴定目的片段的正确性。

1.2.3 重组质粒的构建 以pMD18-OsPIN1a为模板，分别用含有NdeI和XhoI的上下游引物特异性扩增OsPIN1a序列（上游引物：GTCATATGGTGCAGA

TCGTGGTGCTCCAGTG，下游引物：GCCTCGAGTC

ACAGCCCCAGCAGGATG TAGT），后将目的片段连入pET-30表达载体。Quickchange XL site-directed mutagenesis（Stratagene）用于OsPIN1a中Ser-233和Ser-254突变载体构建，具体操作步骤依据说明书进行。

1.2.4 重组质粒在大肠杆菌中表达及蛋白纯化 将pET30-OsPIN1a、pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala）、pET30-OsPIN1a（Ser254/Ala）、pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala，Ser254/Ala）和pET-30空载体分别转入大肠杆菌（BL21）中。选择单克隆在5 mL的LB液体培养基（卡那霉素，50 μg/mL），37 ℃，200 r/min培养过夜；后取2 mL菌液在400 mL LB液体培养液（卡那霉素，50 μg/mL）中放大培养至OD约为0.5，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，18 ℃诱导24 h。通过镍柱亲和层析的方法纯化重组蛋白，具体步骤依据Qiagen公司的蛋白纯化手册进行。

1.2.5 Western blot和重组蛋白体外磷酸化分析 Western blot依据Welinder等[14]所描述的方法操作。带有His标签的PID激酶和纯化的重组蛋白用于体外磷酸化分析[11，13]。将1 μg上述两种蛋白混匀后加入ATP溶液（100 mmol/L MgCl2/ATP和1 μ Ci [γ-32P]ATP）和激酶反应混合液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L DTT和5 mmol/L MgCl2）置于30 ℃反应40 min，后煮沸5 min终止反应。10%的聚丙烯酰胺凝胶用于分离重组蛋白，蛋白膜被密封在塑料的器皿中，置于-20 ℃下曝光24～48 h。P32放射自显影信号强度与考马斯染色结果的比值用于表示蛋白的磷酸化活性。

2 结果与分析

2.1 OsPIN1a基因克隆及分析

依据OsPIN1a基因非编码区序列设计特异引物，分别以水稻DNA和RNA为模板进行PCR扩增。电泳结果如图1所示，在不同的核酸水平上均特异地扩增出一目的条带，与Genbank中已登录的序列大小相符。为进一步验证所得序列的正确性，将上述PCR产物回收并连入T载体中进行测序，所得核苷酸序列与OsPIN1a（GenBank登录号为BR000827）具有99.7%的同源性，个别碱基的差异性可能是测序或PCR扩增产生的误差。同源比对和在线预测（NetPhos program）发现OsPIN1a-d蛋白序列中均含有拟南芥AtPIN1类似PID磷酸化的保守结构域TPRXS（N/S）。

2.2 OsPIN1a体外表达及蛋白纯化

镍柱亲和层析对体外表达的OsPIN1a蛋白进行纯化，结果如图2所示，在约65 ku（含有6个组氨酸）处有一条纯化的蛋白条带。用His抗体对OsPIN1a基因表达结果进行Western blot验证，1泳道空质粒表达的蛋白65 ku处无任何免疫信号；而pET30-OsPIN1a表达（2泳道）和纯化（3泳道）的蛋白均具有较强的免疫信号。由此表明，OsPIN1a蛋白已在大肠杆菌中成功表达。

2.3 OsPIN1a蛋白PID磷酸化位点分析

将OsPIN1a的TPRXS（N/S）结构域中预测的磷酸化位点Ser-233和Ser-254分别用Ala替代，对单突变及双突变基因进行体外表达和纯化，并与PID激酶互作进行磷酸化活性分析。结果如图3所示，泳道1中完整的OsPIN1a蛋白具有较强的磷酸化信号，当233位点的Ser突变为Ala时，放射自显影信号明显降低（泳道2）；类似地，254位点的Ser也可被PID激酶磷酸化（泳道3）；如将上述两位点同时突变时，P32信号强度进一步减弱（泳道4）。

3 讨论与结论

水稻OsPIN1类型的蛋白（OsPIN1a-d）具有较高的同源性，这给单基因分离和功能分析增加了困难。考虑到OsPIN1a-d组织器官表达差异性可能与基因特异的非编码调控区相关[4-5]。至此，本研究选取OsPIN1a基因3′和5′端非编码区设计引物特异地分离了目的基因。由于序列内部引物较难分辨不同的OsPIN1a-d基因，故用启动子结合相应的报告基因（GUS或GFP等）研究其组织定位和基因表达特征将更优于RT-PCR。

光作为重要的环境信号影响着根的负向光性与生长素的极性运输。王忠等[15]和Xu等[16]研究表明，水稻根负向光性与OsPIN1a调控根冠的生长素极性运输形式密切相关。然而，OsPIN1a通过何种机制发挥运输活性仍需进一步明确。拟南芥的AtPIN1亲水性区域TPRXS（N/S）含有多个丝氨酸（如：Ser-337）和苏氨酸（如：Thr-340）磷酸化活性位点[11，17-18]，磷酸化位点突变后的AtPIN1最终定位于根尖的表皮基部，而具有磷酸化活性的AtPIN1则位于顶部。上述结果与PID激酶缺失突变体所表现的特性是类似的[19]，这表明PID激酶可能通过调节AtPIN1的磷酸化活性，进而影响蛋白在细胞中的定位。

TPRXS（N/S）作为PIN蛋白亲水性区域的保守结构域，广泛存在于不同植物中[13]。拟南芥的PID激酶在体外可使TPRXS（N/S）结构域中的Ser磷酸化，影响AtPIN1蛋白在组织中的定位和植株的生长发育[13]。本研究对比发现水稻OsPIN1、OsPIN2和OsPIN10蛋白中均含有TPRXS（N/S）结构域，PID激酶也可使OsPIN1a蛋白保守结构域中Ser（233和254位点）发生体外磷酸化（图3），这表明不同植物同一类型的PIN蛋白可能具有类似的磷酸化激活机制[20]。尽管水稻OsPIN1a中的233和254两个Ser活性位点被突变，但仍具有部分磷酸化信号强度，这与AtPIN1a蛋白体外磷酸化研究结果是一致的[15]，猜测可能OsPIN1a蛋白中含有其它的PID激酶磷酸化位点。而水稻OsPIN5、OsPIN8和OsPIN9蛋白相同位点缺少类似的TPRXS（N/S）结构域，这是由于不同类型的PIN具有不同的激活机制，在调节激素运输过程中具有不同的功能。然而，OsPIN家族不同成员之间如何协同作用调节生长素的极性运输，仍需进一步研究。

参考文献

[1] Parry G， Marchant A， May S， et al. Quick on the uptake： characterization of a family of plant auxin influx carriers[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2001， 20（3）： 217-225.

[2] Paponov I A， Teale W D， Trebar M， et al. The PIN auxin efflux facilitators： evolutionary and functional perspectives[J]. Trends in Plant Science， 2005， 10（4）： 170-177.

[3] Geisler M， Murphy A S. The ABC of auxin transport： the role of p-glycoproteins in plant development[J]. FEBS letters， 2006， 580（4）： 1 094-1 102.

[4] Wang J R， Hu H， Wang G H， et al. Expression of PIN genes in rice（Oryza sativa L.）： tissue specificity and regulation by hormones[J]. Molecular Plant， 2009， 2（4）： 823-831.

[5] Xu M， Zhu L， Shou H， et al. A PIN1 family gene， OsPIN1， involved in auxin-dependent adventitious root emergence and tillering in rice[J]. Plant and cell physiology， 2005， 46（10）： 1 674-1 681.

[6] Davies P J. The plant hormones： their nature， occurrence， and functions[M]. Plant hormones. Springer Netherlands， 2010： 1-15.

[7] 莫亿伟， 王 忠， 钱善勤， 等. 生长素在水稻根负向光性反应中的作用[J]. 中国水稻科学， 2004， 18（3）： 245-248.

[8]Bhalerao R P， Eklof J， Ljung K， et al. Shoot-derived auxin is essential for early lateral root emergence in Arabidopsis seedlings[J]. Plant Journal， 2002， 29（3）： 325-332.

[9] Mravec J， Skupa P， Bailly A， et al. Subcellular homeostasis of phytohormone auxin is mediated by the ER-localized PIN5 transporter[J]. Nature， 2009， 459（7250）： 1 136-1 140.

[10] 丁 懿， 石彩娟， 王万军. 水稻PIN家族的生物信息学分析[J]. 安徽农业科学， 2012， 40（27）： 13 238-13 242.

[11] Michniewicz M， Zago M K， Abas L， et al. Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux[J]. Cell， 2007， 130（6）： 1 044-1 056.

[12] Rashotte A M， DeLong A， Muday G K. Genetic and chemical reductions in protein phosphatase activity alter auxin transport， gravity response， and lateral root growth[J]. Plant Cell， 2001， 13（7）： 1 683-1 697.

[13] Huang F， Zago M K， Abas L， et al. Phosphorylation of conserved PIN motifs directs Arabidopsis PIN1 polarity and auxin transport[J]. Plant Cell， 2010， 22（4）： 1 129-1 142.

[14] Welinder C， Ekblad L. Coomassie staining as loading control in Western blot analysis[J]. Journal of proteome research， 2011， 10（3）： 1 416-1 419.

[15] 王 忠， 莫亿伟， 钱善勤， 等. 水稻根的负向光性及其影响因素[J]. 中国科学： C 辑， 2003， 33（1）： 9-18.

[16] Xu H， Mo Y， Wang W， et al. OsPIN1a gene participates in regulating the negative phototropism of rice roots[J]. Rice Science， 2014， 21（1）： 1 704-1 710.

[17] Nühse T S， Stensballe A， Jensen O N， et al. Phosphoproteomics of the Arabidopsis plasma membrane and a new phosphorylation site database[J]. Plant Cell， 2004， 16（9）： 2 394-2 405.

[18] Benschop J J， Mohammed S， OFlaherty M， et al. Quantitative phosphoproteomics of early elicitor signaling in Arabidopsis[J]. Molecular & Cellular Proteomics， 2007， 6（7）： 1 198-1 214.

[19] Zhang J， Nodzyński T， Pěn？ík A， et al. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2010， 107（2）： 918-922.

[20] Morita Y， Kyozuka J. Characterization of OsPID， the rice ortholog of PINOID， and its possible involvement in the control of polar auxin transport[J]. Plant and cell physiology， 2007， 48（3）： 540-549.

责任编辑：凌青根