布氏艾美耳球虫保定株早熟系的免疫原性研究

廖贵城 刘丽丹 王文莉等

摘 要：经过20代的选育，选育出了布氏艾美耳球虫保定株早熟系虫株，该早熟系虫株与亲本株均对常见的抗球虫药物——克球素、地克珠利、磺胺喹恶啉和尼卡巴嗪高度敏感，敏感性与保定亲本株一致；分别接种200个该早熟系虫株和亲本株孢子化卵囊，21d后鸡群均能抵抗1.0×105个布氏艾美耳球虫强毒株孢子化卵囊的攻击，说明早熟株仍然保持良好的免疫原性。

关键词：布氏艾美耳球虫保定株；早熟株；药物敏感性；免疫原性

中图分类号：S858.312.72+3 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2014）09-0016-04

鸡球虫病是集约化养鸡场中流行普遍、发病率高、危害严重的疾病之一[1]。布氏艾美耳球虫（Eimeria. brunetti）在国内外流行较为广泛，属中等致病力虫种，可明显地降低鸡的饲料转化率和增重，对鸡的生产性能有较强的影响[2，3]。目前鸡球虫病疫苗是防控该疾病的主要手段，国内市面上销售的主要是正典鸡球虫病三价、四价疫苗，而包含布氏艾美耳虫种的疫苗产品只有先灵葆雅公司的八价种鸡球虫活疫苗[1]。本公司采用Jeffers法，经过20代的早熟选育，选育出了布氏艾美耳球虫保定株早熟系虫株，该虫株潜隐期为88h，平均大小为24.4μm×20.0μm，形状指数为1.22，与亲本株一致，繁殖力和致病力显著低于亲本株[3，4，5]。为此，我们将该早熟系虫株进行免疫原性测定，评价该虫株是否可作为疫苗的候选虫种。

1 材料和方法

1.1 材料 布氏艾美耳球虫保定株，布氏艾美耳球虫保定株早熟系虫株和布氏艾美耳强毒株由佛山市正典生物技术有限公司保存[3]；1日龄无球虫感染岭南黄鸡购自广东省农业科学院畜牧研究所种鸡场；无添加抗球虫药物和抗生素的全价饲料购自中山市某饲料公司；克球素，成分为6%葵氧喹酯预混剂，购自广州市科虎生物技术公司；球安，成分为拉沙洛菌素，购自河南大中农动物药业有限公司；地克珠利，0.5%预混剂，购自杭州丰禾生物技术有限公司；磺胺喹恶啉由佛山市正典生物技术有限公司提供；尼卡巴嗪，购自山东鲁西兽药股分有限公司。

1.2 方法

1.2.1 布氏艾美耳球虫保定株的亲本株和早熟系虫株药物敏感性试验

1.2.1.1 将7日龄的无球虫感染鸡随机分成7组，每组10羽；除第6、7组外，其它5组分别于饲料或饮水中添加克球素、球安、地克珠利、磺胺喹恶啉和尼卡巴嗪。饲养1d后，第1～6组的每组鸡感染布氏艾美耳球虫保定株亲本株孢子化卵囊1000个/羽，隔离饲养。分别收集感染后96～192h的粪便。用麦克马斯特方法（Mcmaster method）分别计数各组鸡粪便中排出的卵囊数。以同样的分组处理，第1～6组的每组鸡感染布氏艾美耳球虫保定株的早熟株孢子化卵囊1000个/羽，隔离饲养。分别收集感染后96～192h的粪便。药敏试验见表1。

1.2.1.2 药物敏感性评定指标：以相对卵囊产量（ROP=感染用药组排出的卵囊总数/感染不用药组的卵囊总数×100%）作为判定球虫对药物抗药性的指标；当ROP≥5%，则判定为耐药；当ROP≤5%，则判定为敏感。

1.2.2 布氏艾美耳球虫保定株早熟株免疫原性

1.2.2.1 将鸡随机分成4组，每组10羽，第1组为阴性对照组，不免疫不攻虫；第2组为阳性组，不免疫攻虫组；第3、4组为免疫组，第3组于4日龄经口免疫200个布氏艾美耳球虫早熟株孢子化卵囊，第4组于4日龄经口免疫200个布氏艾美耳球虫保定株孢子化卵囊。置实验室平养，地上铺上木糠作为垫料。25日龄时，第2、3、4组鸡每羽口服攻击1×105个布氏艾美耳球虫强毒孢子化卵囊，攻虫后观察6～7d，记录各组鸡的粪便、精神状况和饮食欲，第7天各试验组称重并剖杀，作病变记分。

1.2.2.2 免疫原性评价标准：粪便记分标准及肠道病变记分；试验鸡攻虫前后增重情况，相对增重率=各试验组的平均增重/阴性对照组的平均增重×100%；免疫保护率。

2 结果

2.1 药物敏感性 布氏艾美耳球虫保定株的亲本株和早熟株药物敏感试验结果见表2。

由表2可知，除了球安用药组外，亲本株和早熟株的其它各用药组的相对卵囊产量（ROP）均≤5%，该虫株的亲本株和早熟株对球安之外的4种药物均敏感。

2.2 免疫原性

2.2.1 鸡增重情况 见表3。

由表3增重结果可见，攻虫后两个免疫组鸡的相对增重稍低于阴性组，但明显高于阳性组；阳性组鸡受强毒卵囊攻击后增重受影响，而免疫了布氏艾美耳球虫早熟株和亲本株的鸡相对增重率相近，说明免疫后能产生一定的免疫力，当用强毒攻击时，对鸡体的影响小于未接受免疫的鸡。

2.2.2 粪便记分、肠道病变记分及保护率 攻虫后6d，阳性组鸡的粪便明显出现异常，发病鸡拉稀、粪便呈黄色水样，鸡只饮食欲下降、精神沉郁、打堆、两翅下垂，脚脱水干瘪；早熟株免疫组和亲本株免疫组鸡粪便正常或含较多水分，鸡只精神良好，有正常饮食，无明显临床发病症状。表4肠道平均病变记分的结果显示，免疫组鸡攻虫后病变明显低于阳性组，用早熟系虫株和亲本株分别免疫后可以抵抗1×105个强毒孢子化卵囊的攻击。

3 分析与讨论

3.1 药物敏感性 早熟株对球虫的抗药性与亲本株比较，虽然早熟株每羽鸡的排卵囊数量与低于保定亲本株，但相对卵囊产量即感染用药组与感染不用药组的比率，显示早熟株与保定株的药物敏感性是一致的，早熟株和保定亲本株都对球安有耐药性，对其余四种药物敏感，说明早熟株具有保定亲本株的遗传特性。

3.2 免疫原性 通过免疫攻虫试验结果可见，早熟株与保定株同样免疫剂量免疫21d后，能够抵抗1×105个布氏艾美耳球虫强毒孢子化卵囊的攻击，阳性组粪便记分为3分，粪便呈水样且含淡黄色粘液，而两免疫组的粪便无明显异常；阳性组平均病变记分为3.2分，两个免疫组肠道平均病变记分均小于1分，从攻虫后增重、粪便记分及病变记分结果表明阳性组与免疫组的差异显著，说明经过早熟选育之后，早熟株具有良好的免疫原性。胡景辉等研究指出，当免疫500个布氏艾美耳球虫孢子化卵囊时，该虫株的免疫效果最好[6]；而在本研究中，当接种剂量为200个时，就可以获得理想的免疫保护效果。一般认为子孢子和第一代裂殖体是球虫产生免疫最重要的阶段，早熟株是球虫在发育史中最后一代裂殖生殖发生缺乏或缺陷，因而早熟系的免疫原性不会因为早熟选育而产生影响[7]。本研究结果表明布氏艾美耳球虫早熟系虫株能使鸡群建立良好的抗布氏艾美耳强毒株免疫力，是鸡球虫病活疫苗理想的候选虫株。

参考文献：

[1] 翁亚彪.鸡球虫病疫苗应用前景[J].养禽与禽病防治，2009，1：2-3.

[2] 陈桂先，刘明如，陈汉忠，等.布氏艾美耳球虫南宁株的分离及鉴定[J].中国畜牧兽医，2011，38（11）：222-226.

[3] 刘丽丹，廖贵城，王文莉，等.布氏艾美耳球虫保定株的鉴定及致病性研究[J].中国畜牧兽医， 2013，40（8）：173-175.

[4] 廖贵城，刘丽丹，吴松明，等.布氏艾美耳球虫保定株早熟系的选育及致病性研究[J].家禽科学，2014，5：15-18.

[5] 王时伟.布氏艾美耳球虫及其早熟株生物学特性的研究[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2004.

[6] 胡景辉，赵永前，李红斌，等.布氏艾美耳球虫（Eimeria brunetti）早熟虫株的免疫原性及毒力[J].中国兽医学报，1998，18（5）：483-485.

[7] 索勋.鸡球虫病学[M].北京：中国农业大学出版社，1998.□