不同来源金线莲活性成分含量的研究

施满容 龚林光 钟幼雄

摘要对福建不同地区野生金线莲和组培苗4、6月栽培种进行多糖、黄酮、氨基酸、总生物碱含量测定，结果表明，闽南野生金线莲4种成分含量均高于闽东野生种，多糖和总氨基酸含量组培苗栽培种均高于野生种，且随栽培月龄增加而下降；总黄酮和总生物碱含量表现随栽培月龄增加而上升，组培栽培6个月最高，其次是闽南野生种。

关键词金线莲；多糖；黄酮；氨基酸；总生物碱

中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）28-09731-04

Research of Activity Components in Different Anoectochilus roxburghii

SHI Manrong1， GONG Linguang2， ZHONG Youxiong1

（1. Ningde Vocational and Technical College， Fuan， Fujian 355000； 2. Fuan Mastery in Quality Supervision and Inspection， Fuan， Fujian 355000）

AbstractPolysaccharides， flavonoids， amino acid， the content of total alkaloids in wild Anoectochilus roxburghii from different regions of Fujian Province and tissue culture seedling（cultivated species in April， June ） were determined. The results showed that， for four kinds of components in wild Anoectochilus roxburghii in south of Fujian， polysaccharides and total amino acid content in plant tissue culture are higher than the wild species in east of Fujian Province， and declines as the cultivation age increases. Total flavonoids and total alkaloids rises as the cultivation age increases. Tissue culture and cultivation are highest in six months， and the second is the wild species in south of Fujian Province.

Key wordsAnoectochilus roxburghii； Polysaccharides； Flavonoids； Amino acid； Total alkaloids

金線莲（Anoectochilus roxburghii）系兰科开唇兰属（金线莲属）多年生草本植物，该属植物已发现有35种，在我国约有20种[1]。金线莲主要分布于亚洲热带和亚热带地区及大洋洲，我国主要分布在海拔 300～1 200 m 的丘陵地，福建、广西、广东、海南、四川、云南、贵州等均有野生金线莲。金线莲对生态环境要求严格，加之近年自然环境遭受严重破坏，以及人工过度采挖，野生金线莲越来越少。它在民间使用范围较广，素有“药王”、“神药”、“金草”、“乌人参”等美称。有研究表明，金线莲中氨基酸组成、成分、含量及抗衰老活性微量元素的含量均高于国产和野生西洋参[2]。金线莲富含多糖、氨基酸、生物碱、黄酮化合物、微量元素、强心苷类、有机酸、甾体化合物等[3]。药效学研究证实了金线莲全草水煎液具有降血糖作用[4]，所含的微量元素、多糖、氨基酸等具有抗衰老、提高机体免疫力的作用[5]。该试验对福建闽东地区野生金线莲、闽南地区野生金线莲和金线莲组培苗栽培4月龄、6月龄苗，进行了多糖、黄酮、氨基酸、生物碱的测定，以期为更好地保护野生金线莲资源、进行组织培养材料选择、开发利用栽培金线莲以及可持续发展金线莲产业提供理论指导。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。金线莲组培栽培4个月苗、金线莲组培栽培6个月苗、闽南野生金线莲苗、闽东野生金线莲苗。测定时间为2014年5月26～28日。

1.1.2主要仪器。7520型紫外可见分光光度计，购自北京普析通用仪器有限公司；EYELA N-1000旋转蒸发仪，购自EYELA公司；SHBIII循环水式真空泵，购自河南郑州长城科工贸有限公司；EASYpure II超纯水仪，购自BarnsTead公司；Sartorius BS 210S 电子天平，购自Sartorius公司。

1.1.3主要试剂。芦丁、甘氨酸、盐酸麻黄碱标准品，购自上海江莱生物科技有限公司；无水葡萄糖、三氯化铝、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、柠檬酸、氰化钾、乙二醇甲醚、茚三酮等试剂均为分析纯，市售。

1.2方法

1.2.1多糖含量的测定。

1.2.1.1标准曲线的绘制。精确称取葡萄糖标准品溶液，分别置于试管（ 18 mm×180 mm）中，加蒸馏水至1.0 ml，加入2.0%苯酚溶液1.0 ml、浓硫酸5.0 ml，混匀，沸水浴加热 2 min，冷却后于分光光度计490 nm 处测定吸光度。以试剂空白溶液为参比，以吸光度（X）为横坐标、质量含量（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.1.2样品处理。取适量药材，洗净、晒干，在40 ℃烘箱中放置1 h，粉碎，过40目筛，精确称取500 mg，置于25 ml容量瓶中，加水至刻度，于80 ℃水浴加热90 min，冷却至室温，提取液摇匀后过滤。滤液中加入50.0 ml无水乙醇，6 000 r/min离心，弃上清液，沉淀用90%乙醇洗涤2次，6 000 r/min离心，弃上清液，沉淀加水溶解，定容至25 ml，即得样品液。

1.2.2总氨基酸含量的测定。

1.2.2.1标准曲线的绘制。取标准氨基酸母液将其稀释成一定浓度，取不同浓度标准氨基酸溶液1 ml，加 0.2 mol/L柠檬酸缓冲溶液（pH=5.0）1 ml，充分混和，加入1 ml KCN-乙二醇甲醚-茚三酮溶液，充分混匀后在100 ℃沸水浴中加热15 min，取出立即加入3 ml 60%乙醇稀释。冷却后，选择波长570 nm进行比色，以吸光度（X）为横坐标、质量含量（Y）为纵坐标作标准曲线。

1.2.2.2样品处理。取适量药材，洗净、晒干，在40 ℃烘箱中放置1 h，粉碎，过40目筛，精确称取500 mg，置于研钵中加少量80%乙醇，研磨成勻浆，移于25 ml容量瓶中，用乙醇将残渣洗入瓶中，最后定容至刻度。过滤，在室温下减压蒸发干燥，蒸发的最后阶段在表面皿上进行，得到固形物。使用前用蒸馏水溶解，定容至25 ml，即得样品液。

1.2.3黄酮含量的测定。

1.2.3.1标准曲线的绘制。采用三氯化铝显色法测定，以芦丁为标准品，精密称取芦丁标准品4.0 mg，用乙醇溶解后定容至10 ml，配成0.4 mg/ml的标准溶液。吸取标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml分别至10 ml容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀。分别取1 ml上述芦丁标准溶液稀释液于10 ml干净试管中，加入1%三氯化铝溶液0.5 ml以及30%乙醇2.0 ml，振荡摇匀，静置反应15 min后在420 nm波长下测定吸光度值，并以吸光度（X）为横坐标、质量含量（Y）为纵坐标制作标准曲线。

1.2.3.2样品处理。取适量药材，洗净、晒干，在40 ℃烘箱中放置1 h，粉碎，过40目筛，精确称取500 mg，置于锥形瓶中，加无水乙醇25 ml，超声处理（功率350 W、频率50 kHz、温度60 ℃）2 h，滤纸过滤，定容至25 ml，即得金线莲样品溶液。

1.2.4总生物碱含量的测定。

1.2.4.1标准曲线的绘制。取盐酸麻黄碱对照品母液将其稀释成一定浓度，取不同浓度标准盐酸麻黄碱溶液1 ml，再精确加入5 ml pH=5.4柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、1 ml 0.1%溴麝香草酚蓝溶液、氯仿10 ml，振摇混匀待用。另取1 ml二次纯化水，同法操作，作为空白对照液，取氯仿层，在波长418 nm进行比色，以吸光度（X）为横坐标、质量含量（Y）为纵坐标作标准曲线。

1.2.4.2样品处理。取适量药材，洗净、晒干，在40 ℃烘箱中放置1 h，粉碎，过40目筛，精确称取1 g，于锥形瓶中用50 ml pH=3的酸性水溶液在功率为70 W、温度为60度的超声条件下提取1h，提取2次，合并提取液；提取液用氨水调节pH至10，于分液漏斗中用等体积氯仿萃取，氯仿萃取液即为样品液。

2结果与分析

2.1多糖、总黄酮、总氨基酸、总生物碱回归方程

对金线莲多糖、总黄酮、总氨基酸、总生物碱的含量进行测定，分别得到葡萄糖、 芦丁、氨基酸、总生物碱的含量标准曲线（图1）以及金线莲的多糖、总黄酮、总氨基酸和总生物碱测定回归方程分别为：Y=0.068 3X+0.003 8（R2=0.999 8）、Y=0.101 5X+0.009 2（R2=0.999 6）、Y=0.095 7X+0.004 6（R2=0.999 6）、Y=0.113 7x-0.020 0（R2=0.999 7）。

图1葡萄糖（a）、 芦丁（b）、氨基酸（c）和总生物碱（d）标准曲线

2.2不同来源金线莲多糖含量的比较

从不同来源和不同栽培月龄金线莲多糖含量测定结果（图2）可以看出，4种金线莲多糖含量为4.74%～10.70%，组培苗栽培种多糖含量均高于野生种，组培苗栽培4个月多糖含量高于栽培6个月多糖含量，闽南野生金线莲多糖含量高于闽东野生种。这可能是由于培养基中碳素营养丰富，有利于糖类的积累，故组培苗栽培种多糖含量高于野生种；同时组培苗栽培4个月的金线莲继代时积累的多糖存在较多，而6个月栽培苗可能多糖已参与物质的代谢过程，故含量有所下降。闽南野生金线莲多糖含量高于闽东野生种可能是由于两者存在遗传物质差异或与2个地区生态环境差异有关。

图2不同来源金线莲多糖含量比较

2.3不同来源金线莲总黄酮含量的比较

由图3可见，不同地区和不同栽培月龄金线莲总黄酮含量为0.38%～0.67%，组培苗栽培6个月总黄酮含量高于4个月栽培种，闽南野生金线莲总黄酮含量高于闽东野生种，其中组培苗栽培6个月总黄酮含量最高，为0.67%，其次是闽南野生种，为0.46%，闽东野生种表现最低，为0.38%。这可能是由于随着栽培时间的延长组培苗中原积累的多糖参与物质代谢，促进了栽培苗内黄酮的积累；至于2个地区野生种黄酮含量差异可能是由于两者存在遗传物质差异或与2个地区生态环境差异有关。

图3不同来源金线莲黄酮含量比较

2.4不同来源金线莲总氨基酸含量的比较

从图4可以看出，不同地区和不同栽培月龄金线莲总氨基酸含量为3.26%～6.10%，组培苗栽培4个月总氨基酸含量（6.10%）高于6个月栽培种（4.14%），闽南野生金线莲总氨基酸含量（3.30%）略高于闽东野生种（3.26%），组培苗栽培种总氨基酸含量均高于野生种。这可能是由于组培苗原培养基中含氮化合物有利于积累氨基酸，故组培苗栽培种氨基酸含量均高于野生种，随着栽培时间延长，氨基酸重新参与物质代谢，故表现出6个月栽培种含量小于4个月栽培种。闽南野生金线莲氨基酸含量高于闽东野生种可能是由于两者存在遗传物质差异或与2个地区生态环境差异有关。

图4不同来源金线莲氨基酸含量比较

2.5不同来源金线莲总生物碱含量的比较

由图5可见，不同地区和不同栽培月龄金线莲总生物碱含量为0.029%～0.066%，组培苗栽培6个月总生物碱含量高于4个月栽培种，闽南野生金线莲总生物碱含量高于闽东野生种，其中组培苗栽培6个月总生物碱含量最高，为0.066%，其次是闽南野生种，为0.051%，闽东野生种表现最低，为0.029%。这可能是由于随着栽培时间延长，组培苗内积累的营养物质参与代谢，有利于生物碱的合成。至于2个地区野生种生物碱含量差异可能是由于本身两者存在遗传物质差异或与2个地区生态环境差异有关。

圖5不同来源金线莲生物碱含量比较

42卷28期

施满容等不同来源金线莲活性成分含量的研究

3结论与讨论

对福建不同地区和不同栽培月龄组培苗进行多糖、总氨基酸、总黄酮、总生物碱含量的测定，结果表明，多糖和总氨基酸含量组培苗栽培种均高于野生种，且随着栽培时间增加而下降；总黄酮和总生物碱含量均表现随着栽培时间增加而上升，其中组培栽培6个月最高，其次是闽南野生种，4种有效成分含量闽东野生种均表现为最低，这是否是由于闽东野生种苗较小，处于生长初期还是由于本身遗传物质差异或2个地方生态环境等自然因素差异有关，还有待进一步研究。多糖含量随栽培时间增加而下降，而总黄酮含量随栽培时间增加而上升，这结果与黄瑞平等的测定结果[6]一致。这可能是因为金线莲在组织培养过程中，培养基营养较丰富，植物的合成代谢较旺盛，多糖和氨基酸作为植物营养物质在体内持续积累，金线莲移入栽培基质后，原积累的多糖和氨基酸参与代谢，故随着栽培时间延长含量降低；黄酮和生物碱作为次生代谢物，可能是在特定环境条件下会增加其合成量，所以，金线莲总黄酮和生物碱含量随着栽培月龄的增加而增加。多糖、总氨基酸、总黄酮、总生物碱是金线莲的主要有效成分，是金线莲产品质量标准的重要成分，其含量的多少将直接影响金线莲及其相关产品的应用功效。

多糖含量栽培4个月最高，达10.70%，比黄瑞平等研究的福建4月龄高[6] ，较王常青等报道的从台湾金线莲试管苗中测得水溶性多糖含量（11.1%）稍低[7]，比赵保发等用水提法从金线莲干草中提取的最高多糖含量（8.23%）高2.47%[8]。4个样品黄酮含量测定结果比黄瑞平等的研究结果[6，9]稍低，但与张志信等报道的野生金线莲（0.4%）含量相当或略高[10]。生物碱也是金线莲的活性成分之一，该研究中，总生物碱的积累以栽培6个月组培苗最高，达0.066%，与林丽清等报道的金线莲干草中最高含量（0.052 96%）高出0.013%，是最低含量（0.033 20%）的2倍[3]。

测定结果表明，组培苗栽培4～6月，多糖、总黄酮、总氨基酸、总生物碱含量可以达到甚至超过野生种，在野生资源日益减少的情况下，大力开展组织培养工作来发展金线莲产业，对保护野生植物资源、满足市场对金线莲作为保健品和药用的需求以及为观赏园艺提供种苗均具有非常重要意义。

参考文献

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