中药活性成分2， 3—吲哚醌与牛血清蛋白作用研究

许潘健 谭明雄

【摘 要】应用荧光光谱技术， 研究了2， 3-吲哚醌在不同温度25℃和37 ℃的条件下与牛血清白蛋白（BSA）的结合机制。结果表明，2， 3-吲哚醌能显著地猝灭BSA的荧光，在25℃时，分子动态猝灭常数Ksv为2.1×104Lmol-1s-1；在37 ℃时，Ksv为4.1×104Lmol-1s-1，温度对ISA与BSA的结合能力有显著影响， 猝灭机制属于动态猝灭。

【关键词】2， 3-吲哚醌；牛血清白蛋白；荧光猝灭

【中图分类号】O65713 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）04-2434-02

Study on Binding of Active Isatin from Chinese Traditional Medicine with Bovine Serum Albumin

XU Pan-jian1， TAN Ming-xiong2，△

（1. Department of clinical laboratory， Yulin Health School， Yulin， Guangxi， 537000， China； 2. College of Chemistry and Materials， Yulin Normal University， Yulin， Guangxi， 537000， China）

【Abstract】The binding mode between Isatin and bovine serum albumin was studied by Fluorescence Spectroscopy at different temperatures of 25 ℃ and 37 ℃. It is showed that Isatin can significantly quench the fluorescence of BSA. The dynamic quenching constant， Ksv， is 2.1×104Lmol-1s-1 at 25 ℃， and 4.1×104 Lmol-1s-1 at 37 ℃. The temperature has a significant effect on the binding capacity of Isatin bound to Bovine Serum Albumin. The mechanism is a dynamic quenching.

【Key words】Isatin； Bovine serum albumin； Fluorescence quenching

血清白蛋白（SA）是血浆中的主要蛋白质，是许多药物转运和分布的载体，中药小分子与血清白蛋白的结合机制研究一直以来引起人们的广泛兴趣，牛血清白蛋白（BSA）一直被广泛研究，部分原因是由于其结构与人血清白蛋白（HSA）的高序列同源性[1-4]。 2， 3-吲哚醌，又名靛红（isatin，ISA），是我国傳统抗癌中药青黛和大青叶中的活性成分，具有抗癌作用[5]， 可以调节血管内皮细胞生长因子， 对动脉粥样硬化调血脂作用[6-7]。 本文通过荧光光谱技术，研究ISA与BSA的结合机制，通过对荧光特征峰及其在不同条件下的位移情况、荧光猝灭等的研究，可以获得蛋白质分子中荧光生色基团结构和所处微环境及其分布情况等有用信息， 同时还可以得到外源物质与生物大分子相互作用的有关数据，对于阐明ISA在体内的运输过程及揭示其抗癌机理具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器

BSA为Sigma公司产品（产品批号A70030），其它所用试剂均为国产分析纯试剂，实验用水为二次去离子水。

TU-1901型紫外可见分光光度计（北京普析仪器有限公司），F-2500型荧光分光光度计（日本岛津公司）， PHS-3C型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）

1.2实验方法

以pH=7.35的Tris-HCl-NaCl缓冲溶液（含100 mmol/L的NaCl以维持溶液的离子强度），配制浓度为1×10-5 mol/L的BSA溶液， 3×10-4 mol/L的ISA溶液，在4°C的条件下冷藏备用。

荧光光谱的测定：移取2 mL浓度为1×10-5 mol/L的BSA溶液，于1 cm的石英比色皿中，用微量注射器逐渐向该溶液加入浓度为3×10-4 mol/L的ISA溶液进行滴定，以280 nm为激发波长，发射狭缝宽度均为5.0 nm，分别测量25 ℃、37 ℃温度下BSA在波长为300～600 nm的荧光光谱。

2 结果

2.1 ISA对BSA荧光的猝灭作用

在温度25℃和37℃条件下，研究ISA与BSA的相互作用，如图1所示。从图中可以看出，BSA在波长为378nm处有强烈的荧光发射峰， 随着ISA浓度的增加而逐渐呈下降的趋势， 但发射峰的位置和形状不变，表明ISA与BSA发生了相互作用，在作用过程中ISA能显著地猝灭BSA的荧光[8-9]。

图1 ISA对BSA荧光的猝灭曲线

2.2 荧光猝灭机制分析

荧光猝灭作用，按其猝灭机制的不同可以分为静态猝灭和动态猝灭， 静态猝灭是指猝灭剂与荧光体之间形成了新的复合物，而动态猝灭是指猝灭剂与荧光体的激发态分子之间的相互作用引起的，其过程遵循Stern-Volmer方程[10]

（1）

式中F0和F分别表示不加入和加入猝灭剂时体系的荧光强度，Kq为双分子猝灭过程速率常数，τ0为未加入猝灭剂时荧光分子的平均寿命，分子荧光寿命约为1×10-8s[11]，Ksv为动态猝灭常数，[Q]为猝灭剂的浓度。假设吲哚醌对BSA的荧光猝灭过程为动态猝灭过程，以F0/F对相应的[Q]作图， Stern-Volmer曲线如图2所示，对所得的曲线图进行线性拟合，求得25℃和37℃时的猝灭常数Ksv及Kq，如表1所示。

对于动态猝灭，Ksv随温度的升高而增大，而对于静态猝灭，Ksv随温度的升高而降低，一般猝灭剂对大分子动态猝灭的最大扩散猝灭常数为2.0×1010（L/moL·s）[11]。由表中计算的结果可知，在298 K时，分子动态猝灭常数Ksv为2.1×104Lmol-1s-1；在310 K时，Ksv为4.1×104Lmol-1s-1。在298 K时，双分子猝灭过程速率常数Kq为2.1×1012Lmol-1s-1；在310 K时，Ksv为4.1×1012Lmol-1s-1，在这两个温度的Kq>2.0×1010（L/mol·s），表明ISA和BSA之间形成没有形成复合物，发生的是动态猝灭。

2.3 ISA和BSA结合的结合常数和结合位点数

当小分子在大分子上有n个相同且独立的结合位点数时，则小分子与生物大分子的结合平衡方程 [12-13]。

（2）

其中K为结合常数，n为结合位点数。以log[（F0-F）/F]对log [Q]作图，如图3所示，在25℃和37℃条件下的结合常数K和结合位点数n的值列于表2。

从表中可以看出，ISA与BSA之间存在较强的作用力，在37℃时，结合常数及结合点位数大于25℃，说明温度影响ISA与BSA的作用能力，温度的提高对药物在血浆中储留的时间缩短，增加了其最大的作用强度。

3 结论

2，3-吲哚醌（ISA）是我国传统抗癌中药青黛和大青叶中的活性成分，采用荧光光谱法，在不同生理温度25℃和37 ℃，pH=7.35的条件下 ISA与BSA发生了相互作用，能显著地猝灭BSA的荧光，属于动态猝灭。在37℃时，结合常数及结合点位数大于25℃，说明温度影响ISA与BSA的结合能力，温度升高使药物在血浆中储留的时间缩短，增加了其最大的利用强度。

研究药物与蛋白质的相互作用在药学、药理学、生物化学上均有重要的意义。本研究可以为药物与BSA在生理上的相互作用提供重要的实验数据，并为环境对BSA构象的影响提供了在相关生理活动方面的有用信息。

参考文献：

[1] Y.Q. Wang， H.M. Zhang， G.C. Zhang， et al. Spectroscopic studies on the interaction between silicotungstic acid and bovine serum albumin[J]. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2007，43 ：1869-1875.

[2] N. Zhou， Y.Z. Liang， P. Wang. 18b-Glycyrrhetinic acid interaction with bovine serum albumin[J]. J. Photochem. Photobiol. A， 2007， 185： 271-276.

[3] C. Bertucci， S. Cimitan， A. Riva， et al. Binding studies of taxanes to human serum albumin by bioaffinity chromatography and circular dichroism[J]. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2006， 42： 81-87.

[4] Y.J. Hu， Y. Liu， R.M. Zhao， et al. Spectroscopic studies on the interaction between methylene blue and bovine serum albumin[J]. J. Photochem. Photobiol. A， 2006，179： 324-329.

[5]王蕾， 曹静， 鞠传霞， 等. 2， 3-吲哚醌抗肿瘤作用研究[J].中国药理学通报， 2007， 23（ 8）： 1052-1056.

[6] 刘占涛， 杨志宏， 赵永娟， 等. 2， 3-吲哚醌对实验性动脉粥样硬化调血脂作用的研究[J]. 中国药理学通报， 2006， 22（ 10）： 1279-1280.

[7] 鞠传霞，侯琳，孙福生， 等. 2， 3- 吲哚醌对血管内皮细胞生长因子的影响及作用机制研究[J].中国药房，2006，17 （24）： 1851-1853.

[8] C.Q. Jiang， T. Wang.Study of the interactions between tetracycline analogues and lysozyme[J]. Bioorg. Med. Chem.， 2004，12： 2043-2047.

[9] Y.J. Hu， Y. Liu， J.B. Wang， X.H. et al. Qu， Study of the interaction between monoammonium glycyrrhizinate and bovine serum albumin[J]. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2004， 36： 915-919.

[10] T.G. Dewey （Ed.）， Biophysical and Biochemical Aspects of Fluorescence Spectroscopy[J]. Plenum Press， New York， 1991， pp. 1-41.

[11] W.R. Ware. Oxygen quenching of fluorescence in solution： an experimental study of the diffusion process[J]. J. Phys. Chem.， 1962， 66 ： 455-458.

[12] M.X. Xie， X.Y. Xu， Y.D. Wang.Interaction between hesperetin and human serum albumin revealed by spectroscopic methods[J]. Biochim. Biophys. Acta ， 2005，17（24）： 215-224.

[13] U. Kragh-Hansen. Molecular aspect of ligand binding to serum albumin[J]. Pharmacol. Rev.， 1981，33： 17-53.

*基金項目：

国家自然科学基金（项目编号：21261025）， 广西自然科学基金项目 （项目编号：013064）

△通讯作者