一株云杉八齿小蠹伴生蓝变真菌的鉴定及致病性测定

曹翠　宋瑞清　周秀华

摘要 [目的]确定1株云杉八齿小蠹伴生蓝变真菌C59的分类地位。[方法]对分离自伊春市五营区黑龙江丰林国家级自然保护区红皮云杉林内的一株云杉八齿小蠹伴生蓝变菌株进行培养特性、形态学特征观察和18S rDNA ITS序列分析鉴定，在对该蓝变菌株进行接种的同时，测定了该菌株的致病性，苗木感病后韧皮部的水分代谢，针叶叶绿素含量，韧皮部可溶性糖、蛋白质、MDA和脯氨酸含量。[结果]该蓝变菌株为Ophiostoma sp.，该菌株使接种苗木韧皮部发生蓝变，影响苗木韧皮部的水分代谢，导致苗木针叶叶绿素含量、韧皮部可溶性糖含量、韧皮部蛋白质含量下降，使苗木韧皮部MDA含量和脯氨酸含量上升。[结论]分离自伊春市五营区黑龙江丰林国家级自然保护区红皮云杉上的云杉八齿小蠹伴生蓝变菌株为Ophiostoma sp.，该菌株对红皮云杉苗木具有很强的致病性。

关键词 红皮云杉；蓝变菌株；鉴定；致病性

中图分类号 S763 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）03-00749-06

Abstract [Objective] The taxonomic status of blue-stain fungal strain associated with Ips typographus isolated from Picea koraiensis was determined. [Method] The blue-stain fungal strain associated with Ips typographus isolated from Picea koraiensis in Heilongjiang Fenglin National Nature Reserve of Wuying district of Yichun city， was identified as Ophiostoma sp. based on culture characteristics， morphological features and 18S ITS sequence analysis. [Result] The result of pathogenicity test showed that the blue-stain fungal strain can make the phloem color of the inoculated seedlings turn to blue； affect water metabolism of seedling phloem； cause chlorophyll content， soluble sugar content and protein content decreased； and led MDA levels and proline content increased. In conclusion， Ophiostoma sp. [Conclusion] The blue-stain fungal strain associated with Ips typographus， isolated from Picea koraiensis in Heilongjiang Fenglin National Nature Reserve of Wuying district of Yichun city has a strong pathogenicity to Picea koraiensis.

Key words Picea koraiensis； Blue-stain fungal strain； Identification； Pathogenicity

紅皮云杉（Picea koraiensis）是我国东北地区的乡土树种，是长白山至小兴安岭森林的主要组成树种之一。红皮云杉木材轻软、细致，可供建筑、家具、造纸等用材。其树姿优美，抗感染力强，又是城市观赏、绿化较佳的树种。因此，红皮云杉是我国经济价值和生态价值均很高的树种之一。

木材蓝变是针叶材价值损失的主要原因之一[1]。木材蓝变主要由具有暗色菌丝的真菌引起，少数真菌分泌着色物质使细胞壁变色。Bridges和Christiansen等研究认为被害寄主树木的死亡是小蠹虫和共生真菌联合作用的结果，而寄主树木木质部组织的蓝变和迅速坏死则主要由真菌所致[2-3]。变色菌引起的变色只渗入木材表面，几乎仅局限于边材，没有或很少与心材有关，故又称边材变色[4]。大量研究已证明了蓝变对木材产品性质的影响。木材变色菌虽然不会导致木材腐朽，但是会使木材变黑、变青或变蓝，导致材面污染。木材蓝变后，除了边材的渗透性增加，还会使木材冲击弯曲强度受损。木材蓝变严重降低木材的使用价值和经济价值，给林业和生态环境建设造成巨大的损失。

笔者在前期研究的基础上，对在黑龙江丰林国家级自然保护区的红皮云杉林内分离的1株云杉八齿小蠹伴生蓝变真菌C59 [5]进行形态学和18S rDNA ITS序列分析，以确定其分类地位，同时对菌株C59的致病性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

蓝变菌株C59：试验菌株分离自黑龙江丰林国家级自然保护区内云杉八齿小蠹坑道内。

接种植物：选自哈尔滨市市郊柳树林苗圃的红皮云杉8年生健康苗木。

1.2 蓝变菌株的鉴定

1.2.1 培养特性及形态学研究。

（1）培养特性研究。将蓝变菌株接种于改良PDA平板培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，水1 000 ml）上，24～25 ℃、黑暗条件下培养。观察菌落的生长状态。

（2）形态特征研究。用改良PDA平板培养基培养蓝变菌株直至产孢。显微镜下观察分生孢子梗、菌丝、分生孢子、子囊壳、子囊孢子等形态特征以及分生孢子的着生方式，照相记录。

1.2.2 18S rDNA ITS序列。

DNA提取采用CTAB法[6]，采用真菌的通用引物进行rDNA ITS序列扩增，引物ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3（20）和ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3（20），由大连宝生物有限公司合成。

PCR扩增在Gene Amp PCR System 9700 PCR仪上进行，20 μl的反应体系扩增条件为：20 μl的反应体系中去离子水11.7 μl，10 ×PCR buffer（含Mg2+ ）2.0 μl，dNTP（ 2.5 mmol/L）2.0 μl，ITS1（20 μmol/L）1.0 μl，ITS4（20 μmol/L）1.0 μl，Taq酶（5 μ/μl）0.3 μl，DNA模板（20 μl）2.0 μl。

PCR反应参数为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，最后在72 ℃延伸10 min，每次反应均设置1个空白对照，以去离子水代替模板，以排除系统误差。PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖（含0.5 μg/ml EB）电泳，在UVP凝胶成像系统下成像保存[7]。

PCR产物测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。将测得的ITS序列在GenBank 进BLAST，从GenBank核酸序列数据库进行比对，获得相似率较高、亲源关系较近的物种，研究其中的系统发育关系。通过DNA MAN及DNAClub软件对所需要的序列进行调整，以UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetric Mean）方法构建系统发育树。

1.3 致病性测定

1.3.1 接种体的制备。

用直径10 mm无菌打孔器，在无菌条件下切取改良PDA平板培养基上培养7 d的蓝变菌株菌落，接种于盛有250 ml改良PD液体培养基的三角瓶（500 ml）中，每瓶接种6片。置25 ℃转速150 r/min摇床中培养15 d后，用垫有双层无菌滤纸的布氏漏斗真空抽滤，滤去菌丝即得接种体原液。

1.3.2 接种。采用针刺后涂抹接种体的方式接种。

在距地面5～20 cm苗木茎部，由上至下按相等间距分别设1、2、4个接种点，每个接种点接种接种体0.1 ml。接种后用塑料薄膜保湿。分别以针刺后不接种（CK1）、针刺后接种无菌液体培养基（CK2）和无处理（CK3）作为对照。每处理设置7个重复。

1.3.3 接种后观测及生理生化指标测定。

分别在接种后的第1、7、14、21、28天测定针叶叶绿素含量并观测接种点上下韧皮部反应区的纵向长度。叶绿素含量测定采用乙醇-丙酮混合浸泡法[8]，韧皮部反应区长度的测量采用直尺测量，重复3次取其平均值[9]。

28 d测定各处理苗木韧皮部其他生理生化指标。水分含量测定采用常压加热干燥法[9]，可溶性糖测定采用蒽酮比色法[8]，可溶性蛋白测定采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[8]，丙二醛采用硫代巴比妥酸法[8]，游离脯氨酸测定采用茚三酮比色法[8]。

1.3.4 数据分析。

采用SPSS软件进行统计分析。数据采用单因素简单方差分析（one-way ANOVA）处理，如处理间有显著差异性存在，进一步应用最小显著差数法（Least Significant Difference，LSD）做多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 蓝变菌株鉴定结果

2.1.1 培养特性及形态学特征。

2.1.1.1 培养特性。菌株在改良PDA平板培养基（直径为90 mm）上生长7 d可长满平板。菌落呈毛毡状较稠密，气生菌丝较少；初为灰白色，后变为灰棕色。在菌落中心形成黑色圈，无气味。在改良PDA培养基上未见子囊果形成。

2.1.1.2 形态学特征。菌丝直或弯曲且有隔，有的有分支。分生孢子梗细长，褐色，长300～600 μm，有分支。分生孢子单细胞，大小5～8 μm×18～24 μm，浅色，长形，偶尔稍弯曲或一段稍尖，原生质分裂成数团（图1）。

2.2 致病性测定结果

2.2.1 苗木韧皮部变色反应。

小蠹虫伴生菌通过小蠹虫的蛀害被携带进入寄主树木组织内，并在树体中生长繁殖，消耗树木养分，破坏韧皮细胞，使韧皮组织坏死，在韧皮部形成1个长椭圆形的棕褐色坏死区域即韧皮反应区，反应区的长度常用衡量菌所产生的致病力強弱，反应区越长，伴生菌的致病力越强，反应区越短，表示伴生菌的致病力越弱[10]。

接种后第1、7、14、21、28天，菌株C59接种苗木其接种点周围的韧皮组织逐渐形成1个纵向、长椭圆形、棕褐色坏死区域，即韧皮部抗性与生理反应区。韧皮反应区长度随时间的延长而逐渐增大，接种后1～21 d，反应区长度增长较快（约0.27 cm/d），之后逐渐减慢，增长约0.23 cm/d。CK1（针刺无接种）和CK2（针刺后接种PD液体培养基）苗木其接种点的反应区长度变化很小，尤其CK1苗木机械损伤区更小（图3）。

对照CK1接种点的反应区为接种时机械伤害所致，因此机械伤害作用较小；而接种菌株C59苗木所形成的较大反应区是菌株C59的侵染所导致。另外，CK2苗木反应区稍大于CK1苗木。这表明无菌培养液对韧皮部变色有一定影响。有关无菌培养液对韧皮部变色的影响有待进一步研究。

2.2.3.3 接种时间对不同接种苗木叶绿素含量的影响。

随着接种后时间的增长，各处理苗木叶绿素含量随时间变化趋势不同（图11）。

CK1-1和CK1-2叶绿素含量呈现下降-上升-急速下降趋势。处理后第1天，与CK3相比，CK1-1、CK1-2和CK1-4叶绿素含量分别下降0.84%、4.64%、2.36%；接种后第21天，CK1-1叶绿素含量上升1.6个百分点，CK1-2和CK1-4分别下降8和21个百分点，之后急速下降；处理后第28天CK1-1、CK1-2和CK1-4叶绿素含量分别下降21.9、36.8、43.0个百分点。

CK2叶绿素含量呈现逐渐下降趋势。处理后第1天，CK2-1、CK2-2和CK2-4的叶绿素含量分别下降5.1、8.5、15.5个百分点，第28天分别下降42.6、50、59.4个百分点。

接种C59苗木其叶绿素含量则呈逐渐急速下降-平稳下降的趋势。接种后第1天，C59-1、C59-2和C59-4叶绿素含量分别下降3.8、17.4、12.8个百分点，之后急速下降；第7天分别下降31.0、37.4、45.0个百分点，之后下降较平稳；第28天下降率分别为57.5、62.7、65.8个百分点。

上述结果一方面可能是由于真菌侵染引起苗木树势衰弱和代谢紊乱，导致苗木的光合能力逐步下降，使叶绿素的生物合成速度减缓；另一方面可能是菌株侵染危害引起植物体内活性氧（如O2-·、H2O2、·OH和O2等）的积累和水分的缺乏[12]，导致叶绿素分解加快，分解速率大于合成速率，进而使叶片逐渐失绿。

2.2.4 苗木韧皮部可溶性糖的变化。

2.2.4.1 不同处理对苗木韧皮部可溶性糖含量的影响。

可溶性糖是植物体内重要的能源储备物，与植物组织的代谢合成有密切关系。不同处理对苗木韧皮部可溶性糖含量的影响显著（图12）。CK3可溶性糖含量最高，CK1和CK2次之，接种C59苗木可溶性糖含量最低。产生上述结果的原因可能是：①菌株C59在苗木韧皮部、木质部间蔓延，使苗木的物质合成和代谢受阻，特别是光合作用产物的运输严重受阻，从而使苗木韧皮部碳水化合物等储备物减少；②菌株C59的侵染引起苗木长势衰弱、针叶失水、枯萎脱落等势必导致苗木光合能力逐步下降，进而引起碳水化合物合成和代谢发生变化，使苗木韧皮部营养物质含量降低；③可溶性糖含量下降也与菌株C59侵染苗木后分解木质部薄壁细胞和利用木质部管胞胞间和薄壁细胞内多糖等物质有密切关系。

2.2.4.2 接种点数量对苗木韧皮部可溶性糖含量影响。

接种点数量与苗木可溶性糖含量呈明显的负相关（图12）。接种后28 d，与CK3相比，CK1-1、CK1-2和CK1-4可溶性糖含量分别下降了2.38、3.49和12.79个百分点，CK2-1、CK2-2和CK2-4分别下降了5.81、10.47、23.26个百分点。接种C59苗木C59-1、C59-2和C59-4则分别下降了38.40、63.00、71.00个百分点。

随着针刺点数的增加，苗木受机械损伤的面积增大，导致可溶性糖含量下降，这一结果与黄瓜植株机械损伤后期可溶性糖含量下降的结果一致[13]，可溶性糖含量下降说明可溶性糖对降低渗透势、维持细胞膨压的贡献大，从而抵抗针刺的损伤。而对于接种C59苗木，除了机械损伤面积增大外，也增加接种C59的量，因此对苗木伤害的严重程度增大。对CK2来讲，无菌培养液中本身就含有可溶性糖，因此随着接种无菌培养液量的增加，导致CK2-4可溶性糖含量高于CK1-4。

2.2.5 苗木韧皮部蛋白质含量的变化。

2.2.5.1 不同处理对苗木韧皮部蛋白质含量的影响。

不同处理对苗木韧皮部蛋白质含量的影响显著（图13）。CK3蛋白质含量最高，CK1、CK2均下降程度小，而接种C59苗木蛋白质含量下降程度最大。

2.2.5.2 接种点数量对苗木韧皮部蛋白质含量影响。

除C59-4外，接种点数量与苗木蛋白质含量呈明显的负相关。处理后28 d，与CK3相比，CK1-1、CK1-2和CK1-4蛋白质含量分别下降了25.6、31、33.1个百分点，CK2-1、CK2-2和CK2-4分别下降了22.3、36.9、48.3個百分点，C59-1、C59-2分别下降了52.4、75.0个百分点。这表明机械损伤和病原菌丝在韧皮部、木质部管胞和木射线薄壁细胞等组织和细胞内的大量蔓延造成苗木的物质合成和代谢紊乱或阻断，导致蛋白质含量减少，另一方面溶酶体的破裂加速了蛋白质的降解[14]。试验中出现了C59-4蛋白质含量下降率低于C59-2的结果，原因可能与接种苗木自身产生免疫蛋白有关。

2.2.6.2 接种点数量对苗木韧皮部MDA含量影响。

接种点数量与苗木MDA含量呈明显的正相关。处理后28 d，与CK3相比，CK1-1 MDA含量下降了10.6%，CK1-2、CK1-4、CK2-1和CK2-2 MDA含量均增加，但上升幅度不明显，分别为10.6%、65.8%、16.6%和39.3%。CK2-4 MDA含量上升的幅度较大，为102.2%。C59-1、C59-2、C59-4的MDA含量分别上升了76.1%、139.6%、247.7%；C59的2点、4点接种处理显著高于1点接种处理。这表明不同程度危害可诱发苗木细胞膜中自由基引起膜脂过氧化作用，使细胞膜损伤的同时造成了过氧化产物MDA的大量产生和不断累积。

2.2.7 苗木韧皮部脯氨酸的变化。脯氨酸是植物蛋白质的组成成分之一，并以游离态广泛存在于植物体中[15]。脯氨酸被认为是植物逆境胁迫的产物，在逆境胁迫下植物体内游离脯氨酸积累是一个普遍现象，脯氨酸的含量也可作为植物生理抗逆性指标。植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但当遭受逆境胁迫时，游离脯氨酸便会积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。它既可能有适应性意义，又可能是细胞结构和功能受损伤的表现，也有依据说明脯氨酸在逆境胁迫下的积累，是对逆境胁迫的一种适应性反应[16]。也有研究证明，脯氨酸积累与组织内碳水化合物含量有一定关系[17]，植物体内缺水时可导致代谢产物脯氨酸的积累。植株体内脯氨酸含量越高说明越能够从环境中吸取水分供植株生长之用。

不同处理对苗木韧皮部脯氨酸含量的影响显著（图15）。CK3脯氨酸含量最低，CK1、CK2次之，接种C59苗木脯氨酸含量最高。

接种点数量与苗木脯氨酸含量呈明显的正相关。处理后28 d，与CK3相比，CK1-1、CK1-2、CK1-4韧皮部脯氨酸含量分别增加7.1、16.2和48.4个百分点，CK2-1、CK2-2、CK2-4分别增加12.9、31.7和146.0个百分点，C59-1、C59-2、C59-4分别增加52.8、112.7和331.7个百分点。接种菌株C59苗木的4点接种处理均显著高于1点、2点接种处理。

上述结果显示，随着机械损伤程度的提高，苗木韧皮部脯氨酸含量增加，表明游离脯氨酸含量的积累是对伤害胁迫适应性反应，是诱导抗性机制的一部分。随着菌株C59接种量的增加，4点接种处理的脯氨酸含量显著高于1点和2点接种处理，结果可能是细胞结构和功能受损伤的表现。苗木含水量的不断下降也导致脯氨酸的积累。综上，由于机械损伤和病原菌的刺激激发了苗木内部的防御机制，使苗木表现出了对逆境胁迫的适应性反应。

另外，试验结果还显示相同接种点数的CK2苗木韧皮部脯氨酸含量均高于CK1苗木，可能是无菌培养液对苗木生长和代谢有一定的影响，尚需进一步研究。

3 结论与讨论

（1）经形态学与18S rDNA ITS序列分析，将采自黑龙江丰林国家级自然保护区红皮云杉林内的1株云杉八齿小蠹伴生蓝变真菌鉴定为蛇口壳属真菌（Ophiostoma sp.）。该菌对红皮云杉苗木具有很强的致病性。

（2）蛇口壳属（Ophiostoma Syd.& P.Syd.）建于1919 年[18]，是经济上重要的病原真菌，许多种都能引起木材变色，如O.piliferum（Fr.）Syd.& P.Syd.和O.ips（Rumbold）Nannf.是较普遍的木材变色真菌，O.ulmi（Buisman）Nannf.是榆树荷兰病的病原菌，O.aenigmaticum K.Jacobs 是从日本云杉上首次分离到的[19]。目前，我国报道该属真菌6种，包括3种 [O.abietinum Marm.& Butin、O.davidsonii（Olchow.& I.Reid）H.Solheim 和O.francke-grosmanniae（R.W.Davidson）deHoog & R.J.Scheff.]分离自马尾松（Pinus massoniana Lamb.）和黑松（Pinus thubergii Parl.）木材，2种[O.pinicola G.H.Zhao（nom.nud.）、O.lignicola（Wollenw.）Goid.]分离自马尾松蓝变木材[20-22]和从云南松（Pinus yunnanensis Franch.）木材中获得的O.minus（Hedgc.）Syd.& P.Syd.[23]。唐明、叶辉等对蛇口壳目真菌、真菌与蠹虫的关系进行了研究[24-25]。

（3）科学家已从被云杉八齿小蠢致死的云杉边材中分离出几种能引起蓝色污斑的真菌。从蓝色污斑前沿分离得到常见的2种真菌是Ceratocystis polonica（现名Ophiostoma polonicum）和C.penicillata（现名Ophiostoma penicillata）。接种结果显示这些真菌能致死健康挪威云杉，在云杉八齿小蠢大发生期，它们是致死云杉的又一因子之一[26]。

（4）菌株C59（Ophiostoma sp.）接入红皮云杉苗木后，菌丝在韧皮部和木质部内管胞和木射线薄壁细胞等组织和细胞内的大量蔓延，造成苗木物质合成、光合作用和其他代谢紊乱或阻断，特别是树木水分和光合作用产物的运输严重受阻，导致针叶的叶绿素降解速率大于合成速率，叶绿素含量不断减少；韧皮部水分及可溶性糖、蛋白质等营养物质也不断减少。笔者研究的结果与蒲晓娟2006年在华山松（Pinus armandi）的研究结果相一致。试验中出现的苗木蛋白质含量随着真菌接种点的增加、接种量的增大而提高的现象，可能与苗木自身产生免疫蛋白有关。

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