人脐带间充质干细胞治疗慢性HIV感染者的回顾性研究

王嗣予，金磊，李元元，黄辉煌，徐若男，福军亮，张政，王福生

人脐带间充质干细胞治疗慢性HIV感染者的回顾性研究

王嗣予，金磊，李元元，黄辉煌，徐若男，福军亮，张政，王福生

目的明确人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derivedmesenchymal stem cells,UC-MSC）治疗慢性HIV感染者的长期安全性和有效性。方法回顾性分析2009年3月—2012年7月在我院接受UC-MSC治疗的57例慢性HIV感染者随访3年的资料。根据UC-MSC治疗前CD4+T淋巴细胞水平，将所有患者分为≤200个/mm3组（免疫重建失败组）和> 200个/mm3组（免疫重建成功组）。分析UC-MSC治疗的长期安全性和有效性。结果2组患者接受UC-MSC治疗1、2、3年，其外周血CD4+T淋巴细胞计数及CD4/CD8比值均较基线水平显著升高。进一步分析发现，免疫重建失败组UC-MSC治疗1年和2年的有效率（以CD4+T淋巴细胞计数较基线水平升高30%为有效）显著高于免疫重建成功组。2组随访中未发现明显不良事件，安全性好。结论UC-MSC治疗慢性HIV感染者3年安全性好，可显著持续升高外周血CD4+T淋巴细胞计数和CD4/CD8比值，UC-MSC治疗免疫重建失败患者疗效更为显著。本研究提示慢性HIV感染者免疫重建失败可能是UC-MSC治疗的适应证。

获得性免疫缺陷综合征；HIV；间充质干细胞；治疗结果

AIDS是由HIV-1感染后引起的一种严重危害人类健康的致死性传染病。在我国HIV-1感染者目前已达78万，并正以每年40%的速度增长[1]。高效抗反转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy,HAART）显著抑制了病毒复制，减少了机会性感染和肿瘤的发生，降低了HIV-1感染者的病死率[2-3]。然而，近年来发现，在接受HAART大于2年的患者中，仍有20%的患者即使其病毒复制长期受到抑制，但其外周血CD4+T淋巴细胞数量却始终难以恢复，这部分患者被称为免疫重建失败患者[4-6]。免疫重建失败发生的具体机制目前尚不清楚，可能与胸腺功能障碍[7]、抗病毒治疗前CD4+T淋巴细胞数量[8]、共感染情况以及机体免疫超活化状态有关[9-11]。

对于免疫重建失败患者，目前临床上尚无特异有效的治疗方法。采用白细胞介素-7治疗已经初步显示出良好的治疗前景，但缺乏大样本、随机、对照试验证实其疗效[12-13]。我们前期应用人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymalstem cells,UC-MSC）开展了小样本、随机、对照试验，发现UC-MSC治疗免疫重建失败1年安全性好，能显著增加患者CD4+T淋巴细胞数量，显示出良好的临床应用前景[14-15]。本研究通过回顾性观察接受UC-MSC治疗的57例慢性HIV感染者，旨在阐明UC-MSC治疗免疫缺陷患者的长期（3年）安全性和有效性，为发现UC-MSC治疗的适应证提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 对象选择57例2009年3月—2012年7月在解放军第三〇二医院就诊的慢性HIV感染者，其中男51例，女6例，平均年龄39岁（18～55岁）；44例感染途径为性传播，13例为血液传播；平均感染时间73个月，接受HAART平均31周。诊断依据《艾滋病诊疗指南》[16]，并排除现症机会性感染、肿瘤等并发症。

1.2 治疗和随访本研究获得解放军总后勤部卫生部批准（卫医疗［2009］126号），并在美国国立卫生院临床试验网站完成注册（NCT01213186），得到解放军第三〇二医院医学伦理委员会通过。患者签署知情同意书后，接受静脉回输UC-MSC。首个疗程时，分别于0、1、2个月给予3次回输，每次回输3×107个细胞；部分患者在首次治疗的第2～3年接受第2个或第3个疗程治疗。患者平均接受UCMSC治疗4次。记录患者治疗基线、1年、2年、3年的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞计数、血常规和肝肾功能等生化指标，以及病情变化和病史。

1.3 UC-MSC细胞培养参加UC-MSC细胞培养及质量控制的人员均经过良好操作规范（goodmanufacturing practice,GMP）培训和健康查体，符合GMP上岗要求。在符合GMP的实验室条件下，取新生儿脐带剪成0.2～0.5 cm3小块组织，加入无血清培养基，6～10 d UC-MSC贴壁后传代。回输前将细胞悬浮于0.9%氯化钠溶液。具体培养及回输方法见文献［17］。

1.4 实验室检查肝功能检测使用日本Olympus生化分析仪，试剂为英国朗道公司产品。采用荧光定量RT-PCR法检测血清HIV RNA，试剂盒由北京匹基生物制品有限公司提供，PCR仪为美国ABI公司7900型。外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞绝对计数检测方法参考文献［14-15］。

1.5 统计学处理使用SPSS 13.0软件进行统计分析，定量数据以中位数（最小值，最大值）表示，定性资料以频数或百分比表示。2组定量资料采用Mann-Whiteny U检验，2组1、2、3年时间点数据与基线水平比较采用Wilcoxon配对检验。2组定性资料比较采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况根据UC-MSC治疗前CD4+T淋巴细胞水平，将患者分为≤200个/mm3组（免疫重建失败组）和＞200个/mm3组（免疫重建成功组）。2组患者基线水平的性别比例、年龄、感染途径和接受HAART时间等差异均无统计学意义。但免疫重建失败组CD4+T淋巴细胞最低计数、UC-MSC治疗前CD4+T淋巴细胞计数及CD4/CD8比值均显著低于免疫重建成功组（表1）。

表1 UC-MSC治疗慢性HIV感染者基线数据Table 1 Baseline data of patients w ith chronic HIV infection treated w ith UC-MSC

2.2 长期有效性观察随着随访时间延长，2组均有部分患者失访，其原因主要包括：经济问题不愿随访、工作改变随访不方便以及参加其他临床试验等。进一步分析我们发现：免疫重建失败组患者接受UC-MSC治疗1年和2年外周血CD4+T淋巴细胞计数较基线水平显著升高（P＜0.01），而治疗3年CD4+T淋巴细胞计数保持在高水平，但差异无统计学意义。而免疫重建成功组患者接受UC-MSC治疗1、2、3年外周血CD4+T淋巴细胞计数较基线水平均显著升高（P＜0.01）。2组在治疗1、2、3年CD4/CD8比值均较基线水平显著升高（P＜0.01）。见表2。

表2 UC-MSC治疗后慢性HIV感染者外周血T淋巴细胞计数及肝肾功能改变Table 2 Changes of peripheral blood T lym phocyte counts and liver and kidney function parameters of patients w ith chronic HIV infection after UC-MSC treatment

2.3 血常规和肝肾功能指标比较基线和治疗1、 2、3年不同时间点免疫重建失败组和免疫重建成功组WBC、淋巴细胞计数、HGB、PLT、ALT、AST、BUN、CRE和肝肾功能等变化情况，结果表明在治疗前及治疗各时间点各指标差异均无统计学意义（表2）。

2.4 UC-MSC治疗有效率我们将UC-MSC治疗后CD4+T淋巴细胞计数或CD4/CD8比值较基线水平升高30%定义为治疗有效，从而进一步比较2组 UC-MSC治疗的有效率。分析发现：免疫重建失败组UC-MSC治疗1、2、3年CD4+T淋巴细胞计数升高有效率分别为16/27、12/15和3/5，而免疫重建成功组分别为7/26、7/17和7/9（表3）。统计学分析发现，免疫重建失败组UC-MSC治疗1年和2年有效率显著高于免疫重建成功组。免疫重建失败组UCMSC治疗1、2、3年CD4/CD8比值升高有效率分别为9/27、10/15和5/5，而免疫重建成功组分别为13/26、11/17和7/9。2组比较差异无统计学意义（表4）。

表3 2组接受UC-MSC治疗后各年度CD4+T淋巴细胞计数升高有效率比较（累计有效例数/累计存活例数）Table 3 Comparison of annual efficacy of the increased CD4+T lymphocyte counts between the two groups after UC-MSC treatment(cumulative effective cases/cumulative survival cases)

表4 2组接受UC-MSC治疗后各年度CD4/CD8比值升高有效率比较（累计有效例数/累计存活例数）Table 4 Com parison of annual efficacy of the increased CD4/CD8 ratio between the two groups after UC-MSC treatment(cumulative effective cases/cumulative survival cases)

2.5 患者安全性观察2组随访2年，未发现明显不良事件。UC-MSC回输后大部分患者自觉精神状态改善，食欲增强，睡眠改善，体重增加，抗病毒药物导致的乏力、胃肠道不适、皮疹等不良反应减轻。

3 讨论

我们前期应用UC-MSC治疗长期接受HAART的HIV感染者并随访1年，研究发现：UC-MSC治疗免疫缺陷患者安全性好[14]，可显著提高免疫重建失败患者CD4+T淋巴细胞计数和CD4/CD8比值，同时降低患者炎症程度，充分显示了良好的治疗前景[15]。本研究通过回顾性观察57例接受UC-MSC治疗的AIDS患者，旨在阐明UC-MSC治疗免疫缺陷患者的长期（3年）安全性和有效性。

UC-MSC治疗在1年内可有效升高免疫重建失败患者的CD4+T淋巴细胞水平[14]，但是否有助于免疫重建成功患者CD4+T淋巴细胞水平的恢复尚不清楚。在本研究中，我们根据UC-MSC治疗前患者的CD4+T淋巴细胞计数，将其分为≤200个/mm3组（免疫重建失败组）和＞200个/mm3组（免疫重建成功组）。结果发现，免疫重建成功患者在接受多次UC-MSC治疗后，CD4+T淋巴细胞计数可稳定升高，CD4/CD8比值也逐渐升高。结合我们前期的报道，我们的研究提示：UC-MSC对接受HAART的AIDS患者CD4+T淋巴细胞计数均有升高作用；UC-MSC治疗后，免疫重建失败患者1年和2年有效率（较基线水平升高30%视为有效）均显著高于免疫重建成功患者，提示接受HAART的免疫重建失败是UC-MSC治疗的更有效适应证。

UC-MSC治疗对接受HAART的患者是否能长期维持其疗效尚不清楚。我们发现，UC-MSC治疗1～3年，患者CD4+T淋巴细胞计数持续升高；与此同时，CD4/CD8比值也持续稳定升高。值得注意的是，免疫重建失败患者第3年CD4+T淋巴细胞计数较第2年并未进一步升高，其原因尚不清楚，可能与UC-MSC回输人体后不能长久发挥治疗作用有关，也可能与免疫重建失败患者自身的免疫状态有关，因为对于免疫重建成功患者，其第3年CD4+T淋巴细胞计数较第2年进一步升高。将来的研究应该阐明回输的UC-MSC在患者体内的存活时间及半衰期等动力学特征，并探索最佳的临床治疗方案，包括最佳治疗剂量、时机和治疗次数等[18]。

本研究还观察了UC-MSC治疗3年的安全性，发现UC-MSC治疗3年期间患者肝肾功能及血常规均无显著变化，提示UC-MSC治疗具有良好的长期安全性。当然，本研究尚有一些不足之处。首先，本研究是回顾性研究，缺乏很好的对照，因此，UC-MSC治疗AIDS患者的长期安全性和有效性尚需要随机、对照试验进一步证实。其次，本研究中并非所有病例都完成3年随访，也势必影响3年疗效的准确判断。

总之，本研究发现UC-MSC治疗3年安全性好，可持续升高患者外周CD4+T淋巴细胞计数和CD4/ CD8比值；其中，UC-MSC治疗免疫重建失败患者疗效更为显著。该研究为明确UC-MSC治疗AIDS患者的适应证提供了科学的参考依据。

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（2013-07-19收稿 2013-09-20修回）

（责任编委 赵敏 本文编辑 王姝）

Retrospective study on human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell treatment for patientsw ith chronic HIV infection

WANG Si-yu,JIN Lei,LIYuan-yuan,HUANG Hui-huang,XU Ruo-nan,FU Jun-liang,ZHANG Zheng,WANG Fu-Sheng*
Chinese PLA Medical School,Beijing 100853,China
*Corresponding author,E-mail:fswang302@163.com

Objective To investigate the long-term safety and efficacy of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells(UC-MSC)treatment for patients with chronic HIV infection.M ethods The data of 3-year follow-up for 57 patients with chronic HIV infection treated in our hospital from Mar.2009 to Jul.2012 were analyzed retrospectively.According to the CD4+T lymphocyte counts prior to UC-MSC treatment,these patients were divided into two groups,≤200 cells/mm3group(immunological non-responder group)and>200 cells/mm3group(immunological responder group).The long-term safety and efficacy of UC-MSC treatment were analyzed.Results peripheral CD4+T lymphocyte counts and the ratio of CD4/CD8 at 1-year,2-year and 3-year UC-MSC treatmentwere found to increase significantly as compared with baseline level.Further analysis indicated that 1-year and 2-year therapeutic efficacy(defined as a 30%increase of CD4+T lymphocyte counts as compared with baseline level)in immunological non-responder group was significantly higher than that in immunological responder group.UC-MSC treatmentwas found to be safe as no significantside effects occurred in the two groups during 3-year follow-up period.Conclusions UC-MSC treatment iswell tolerant for 3 years.Peripheral blood CD4+T lymphocyte counts and the ratio of CD4/CD8 increase significantly,and UC-MSC treatment ismore effective in improvement of CD4+T lymphocyte counts in immunological non-responders.This study suggests that immunologicalnon-response to HAARTmay be an indication of UC-MSC treatment in patientswith chronic HIV infection.

acquired immunodeficiency syndrome;HIV;mesenchymal stem cells;treatment outcome

R512.91

A

1007-8134(2014)01-0025-04

国家“十二五”科技重大专项（2013ZX10001002001-002）；国家优秀青年基金（81222024）

100853北京，解放军医学院（王嗣予）；100039北京，解放军第三〇二医院生物治疗研究中心（王嗣予、金磊、李元元、黄辉煌、徐若男、福军亮、张政、王福生）

王福生，E-mail:fswang302@163.com