抗菌药物对氟康唑动态抗真菌作用及透过生物膜的影响

杨久丽 孙素梅 刘书源 孙淑娟

（1山东大学附属千佛山医院，山东济南 250014；2山东博士仑福瑞达制药有限公司，250101；3山东大学药学院，250012）

抗菌药物对氟康唑动态抗真菌作用及透过生物膜的影响

杨久丽1孙素梅2刘书源3孙淑娟1

（1山东大学附属千佛山医院，山东济南 250014；2山东博士仑福瑞达制药有限公司，250101；3山东大学药学院，250012）

目的：测定试验用抗菌药物与氟康唑联合的动态抗真菌作用，并评价试验用抗菌药物对氟康唑透过生物膜的影响。方法：采用活菌计数法描绘联合用药对白色念珠菌的动态杀菌曲线，以“三明治”透膜实验法评价试验用抗菌药物对氟康唑透过生物膜的影响。结果：试验抗菌药物对氟康唑有不同程度的增效作用，其中米诺环素和利福平对氟康唑透过耐药白色念珠菌生物膜的作用及其对氟康唑动态抗真菌的增效作用最强，氧氟沙星、阿奇霉素等次之。结论：试验用抗菌药物能促进氟康唑透过白色念珠菌生物膜，增强氟康唑的动态抗真菌作用。

氟康唑；白色念珠菌；抗菌药物；联合抗真菌作用

近年来，随着广谱抗菌药物、激素、免疫抑制剂的广泛使用，器官移植和外科介入治疗的不断发展，恶性肿瘤、糖尿病以及获得性免疫缺陷综合征患者的不断增多，使临床深部真菌感染的发病率急剧上升[1]，尤其是念珠菌，在住院患者的感染中最为常见。而抗真菌药物的广泛、大量使用，又使临床治疗中真菌耐药问题日渐突出[2-3]，给临床用药选择带来了巨大的压力。在加强新抗真菌药物开发的同时，从现有的药物中寻找可以增加白色念珠菌敏感性的药物具有重要的意义。目前，联合用药作为解决耐药真菌感染的主要方法之一，成为近年来的研究热点，受到广泛关注。本研究以多种方法评价米诺环素、磷霉素、大环内脂类和氟喹诺酮等抗菌药物与氟康唑的联合抗真菌作用，应用动态杀菌曲线法测定一系列抗菌药物与氟康唑对白色念珠菌的体外抗真菌活性，并通过“三明治”实验观察抗菌药物对氟康唑透过耐药白色念珠菌生物膜的影响，筛选出对氟康唑有增效作用的抗菌药物以进行更深入的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株质控白色念珠菌ATCC10231，山东大学药理教研室惠赠；实验菌株CA10（FLC耐药菌，MIC=512）与CA14（FLC敏感菌，MIC= 0.5）为山东省千佛山医院临床分离的白色念珠菌。

1.1.2 主要试剂氟康唑（fluconazole，FLC），山东诚创医药科技发展有限公司；米诺环素（minocycline），山东磐信生物科技有限公司；利福平（rifampicin），山东绿源天然原料有限公司；阿奇霉素（azithromycin），石药集团欧意药业；氧氟沙星（levofloxazin），广州白云山制药股份有限公司；磷霉素（fosfomycin），中国药品生物制品鉴定所；二甲基亚砜（DMSO），中国尧舜进出口公司；RPMI 1640原料药粉，美国GIBCO公司；3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS），济南朋远生物技术有限公司；TTC-沙保罗琼脂，杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备-20℃下保存的白色念珠菌室温下解冻，接种到TTC-沙保罗琼脂培养基上，35℃培养24～48 h。取发育良好的单一菌落再次接种，35℃培养24 h，以保证菌株处于生长期。选取若干单个较大菌落，磷酸盐缓冲液（PBS）配制成菌悬液，经涡旋器振荡均匀后以中国细菌浊度标准管比浊，调整样品管与标准管浊度一致，此时白色念珠菌的菌浓度约为4.5×106CFU/mL，系列稀释即得到工作菌液，并以活菌计数进行浓度验证。

1.2.2 RPMI 1640液体培养液配制[4]取RPMI 1640（含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠）粉末2.08 g，加入10%葡萄糖溶液40 mL（含糖终浓度2%）及MOPS粉6.906 g，加蒸馏水至约为200 mL，混合均匀后在22℃用1 mol/L的NaOH溶液调pH约为（7.0±0.1），临用前用0.22 μm混合纤维膜过滤灭菌。

1.2.3 药物溶液配制氟康唑用灭菌注射用水溶解，配成2 560 μg/mL的储备液，过滤分装；磷霉素用灭菌注射用水，阿奇霉素、米诺环素、氧氟沙星用二甲基亚砜溶解，分别配成6 400 μg/mL的储备液，分装。所有药液于-20℃冰箱保存，备用。

1.2.4 试验用抗菌药物与氟康唑联合动态抗真菌作用

将浓度为2 560 μg/mL的氟康唑和浓度均为6 400 μg/mL的各抗菌药物储备液以RPMI 1640液体培养基稀释成10倍工作浓度。将初始浓度约为4.5×106CFU/mL的菌液以RPMI 1640稀释为10倍工作菌液浓度，并通过活菌计数法进行浓度验证。取上述制备的药液500 μL加入到相应试管内，再加入RPMI 1640液体培养基至液体总体积为4.5 mL；此时取按上述方法制备的菌液500 μL加入到此4.5 mL含（或不含）药物的培养基内，震荡混匀。本实验分为4组，即：生长对照组（不加药）、各抗菌药物单用组、氟康唑单用组、各抗菌药物与氟康唑联合用药组，共12个体系。每个体系总体积为5 mL，体系内氟康唑、米诺环素、利福平、氧氟沙星、阿奇霉素和磷霉素的终浓度分别为4 μg/mL，8 μg/mL，8 μg/mL，0.5 μg/mL，0.5 μg/mL和8 μg/mL，体系内菌液终浓度约为4.5×103CFU/mL。将制备完毕的体系于35℃静置培养，于药物作用的第0，6，12，24，48 h的时间点取样测定。

在取样时间点将各体系在蜗旋振荡器上震荡混匀，每个体系中分别取出100 μL的菌悬液，以灭菌注射用水进行系列稀释，取1 mL稀释后的菌液与大约处于35～40℃的液态TTC-沙保罗琼脂培养基混匀，室温下水平放置使其凝固，35℃恒温培养48小时，此时培养基内的菌落清晰可辨，利于计数，每次取计数个数在30～500个范围内的两个平板进行计数，将计数结果乘以相应的稀释倍数，即可得体系中的菌液浓度（CFU/mL），取两个平板的平均值记录结果，实验重复3次。

1.2.5 生物膜制备将CA10菌株传代后于YPD液体培养基35℃培养24小时，3 000 rpm离心5 min，PBS重悬，按照中国浊度标准比浊，使菌液的浓度为4.5×106CFU/mL，取此浓度的菌液200 μL加入1.8 mL的PBS中，使菌液浓度稀释为4.5×105CFU/mL，备用。将提前灭好菌的载体膜放入TTC培养基中，取40 μL 4.5×105CFU/mL的菌液，小心滴入载体膜（13 mm的微孔滤膜），放入恒温培养箱，35℃培养24 h。

1.2.6 药物透膜实验将培养好的载体膜和生物膜系统取出，放入加药YPD平板中，将靠近生物膜的一侧放入面积大于生物膜的0.22 μm的混合纤维素酯微孔滤膜，然后将提前润湿的空白纸片放于滤膜上，形成“三明治”系统，见图1。将制备好的平板放于恒温培养箱35℃培养24小时。取出空白纸片，放入YPD CA14菌板中，35℃培养24小时，观察，测量抑菌圈。

图1 药物透过白念珠菌生物膜系统示意

生物膜是在琼脂培养基直径为13 mm的微孔滤膜上形成的，然后覆盖上直径为10 mm的混合纤维素酯膜，最后将提前润湿的空白纸片至于最上端，整个系统在含有药物的固体培养基中进行培养。

2 结果

2.1 时间-杀菌作用测定结果

将各个时间点联合抗真菌作用的结果连结成曲线，可观察联合用药后的动态作用效果，如图2所示。在4.5×103CFU/mL的菌液中，12 h之前加药组和对照组OD值的变化不大，12 h以后各组菌液的浓度开始出现差别，与对照组相比，各个含有氟康唑的抗菌药物组开始生长都几乎延迟了12 h。与单用氟康唑相比较，联合应用利福平的效果最好；其次是联用米诺环素组，在48 h内的作用效果较好；而联用氧氟沙星、阿奇霉素和磷霉素时，与氟康唑单用比增效不明显。

图2 菌落计数法测定CA10的时间-杀菌曲线

氟康唑、米诺环素、利福平、氧氟沙星、阿奇霉素和磷霉素的浓度分别为4 μg/mL，8 μg/mL，8 μg/mL，0.5 μg/mL，0.5 μg/mL和8 μg/mL。

2.2 实验用抗菌药物对氟康唑透过生物膜的影响

实验抗菌药物对氟康唑透过生物膜的影响以“三明治”实验评价，抑菌圈的大小表示氟康唑透过生物膜量的多少。每个平板分别设有氟康唑单用组（a），两个不同浓度的抗菌药物与氟康唑联用组（b，c）。实验结果见图3。从图可见不同浓度的抗菌药物与氟康唑联用组均比氟康唑单用的抑菌圈要大，特别是利福平、米诺环素与氧氟沙星，说明联用的抗菌药物能促进氟康唑透过生物膜，从而增强氟康唑的作用效果。

图3 氟康唑与抗菌药物联用透过耐药菌生物膜产生的抑菌圈

在图3中，a代表氟康唑单用，浓度为400μg/mL；b和c分别为不同浓度的抗菌药物和氟康唑联合应用。联合应用的药物浓度分别为米诺环素（1 μg/mL，2 μg/mL）；利福平（4 μg/mL，8 μg/mL）；氧氟沙星（0.062 5 μg/mL，0.25 μg/mL）；阿奇霉素（0.5 μg/mL，2 μg/mL）；磷霉素（1 μg/mL，8 μg/mL）。

3 讨论和结论

3.1.联合动态抗真菌作用评价

面对临床应用抗真菌药物较少且已出现的耐药这一现象，大力研制新型的抗真菌药物非常重要，而通过联合用药的手段来增加真菌对药物的敏感性也是克服耐药的一种较好的选择。文献报道，四环素类抗生素米诺环素自身仅具有微弱的抗白色念珠菌的作用[6-10]，MIC大多在128～512 μg/mL之间，而在体内米诺环素却远远达不到此浓度。另外，研究表明多西环素与氟康唑联用时，能增加对白色念珠菌生物膜的效应[11]。我们前期研究表明[12]米诺环素等抗菌药物与氟康唑联用，对耐药白色念珠菌具有明显的协同作用。目前联合抗真菌作用的评价有多种方法，各种方法由于其数据获取与结果分析方法的不同，其结论往往存在差异；加之不同的实验结果可揭示药物不同方面的特征。为了评价氟康唑与多种抗菌药物联合应用抗真菌活性的速度和程度随时间的变化的情况，本次实验进行了药物的动态抗真菌作用测定，即将一定浓度菌悬液暴露于各种浓度的药物或药物组合，于不同时间点取样进行菌落计数，进一步评价联合用药的作用结果。实验结果表明，与氟康唑单用比较，联合用药组氟康唑与利福平联合效果最好，起到直接杀菌作用；其次为米诺环素，在48 h内联合作用明显；而联用氧氟沙星、阿奇霉素和磷霉素，则结果无明显差别。该结果与前期的棋盘法作用结果一致。

3.2 氟康唑透过生物膜实验

生物膜形成是导致真菌耐药的一个重要因素，生物膜中的细胞比浮游菌耐药性可强10～1 000倍[5]，因此，本实验评价了抗菌药物对氟康唑透过生物膜的影响。实验结论显示，不同浓度的抗菌药物与氟康唑联用组均比氟康唑单用的抑菌圈要大，特别是利福平、米诺环素与氧氟沙星，说明联合用药的抗真菌作用增强可能与克服了生物膜的物理屏障，促进氟康唑透过生物膜有关。具体分子机制有待进一步研究。

[1]Kanfman CA，Vazquez JA，Sobel JD，et a1.Prospectivemuhicemer surveillance study of funguria in hospitalized patients.The National Institute for Allergy and Infectious Diseases（NIAID）Mycoses study Group[J].Clin Infer Dis，2000，30（1）：14-18.

[2]Denning DW，Muoz P.Advances in invasive fun infection and antifuntempy：Introduction[J].Cli Micmbiol Infect，2001（S2）：vi.

[3]周贵民，谢灵.国内酵母菌感染和实验室诊断的现状及建议[J].中华医学检验杂志，1996，19（5）：301-303.

[4]Espinel-Ingroff A，Barchiesi F，Cuenca-Estrella M，et al.International and multicenter comparison of EUCAST and CLSI M27-A2 broth microdilution methods for testing susceptibilities of Candida spp.to fluconazole，itraconazole，posaconazole，and voriconazole[J].J Clin Microbiol，2005，43（8）：3884-3889.

[5]Mah TF，O’Toole GA.Mechanisims of biofilm resistance to antimicrobial agents[J].Trend Microbiol，2001，9（1）：34-39.

[6]Lew MA，Beckett KM，Levin MJ.Antifungal activity of four tetracycline analogues against Candida albicans in vitro：Potentiation by amphotericin B[J].J Infect Dis，1977，136（2）：263-270.

[7]Raad I，Darouiche R，Hachem R，et al.Antibiotics and preventionof microbial colonization of catheters[J].Antimicrob Agents Chemother，1995，39（11）：2397-2400.

[8]Schierholz JM，Pulverer G，Bach A，et al.In vitro activity of rifampin-minocyclin coating to Candida albicans[J].Crit Care Med，1999，27（8）：1691-1693.

[9]Wilson M，O’Connor B，Newman HN.Isolation and identification of bacteria from subgingival plaque，with low susceptibility to minocycline[J].J Periodontol，1991，28（1）：71-78.

[10]de Oliveira LF，Jorge AO，Dos Santos SS.In vitro minocycline activity on superinfecting microorganisms isolated from chronic periodontitis patients[J].Braz Oral Res，2006，20（3）：202-206.

[11]Miceli MH，Bernardo SM，Lee SA.In vitro analyses of the combination of high-dose doxycycline and antifungal agents against Candida albicans biofilms[J].Int J Antimicrob Agents，2009，34（4）：326-332.

[12]Shi W，Chen ZZ，Chen X，et al.The combination of minocycline and fluconazole causes synergistic growth inhibition：an in vitro interaction of antifungal and antibacterial agents[J].FEMS Yeast Res，2010，10（7）：885-893.

The Impact of Antibacterial Agents on Dynamic Antifungal Effects of Fluconazole and Biofilm Penetration

Yang Jiuli1，Sun Sumei2，Liu Shujuan3，Sun Shujuan1（1 Qianfoshan Hospital Affiliated to Shandong University，Shandong Jinan 250014，China；2 Shandong Bausch＆Lomb Freda Pharmaceutical Co.，Ltd.，250101；3 School of Pharmaceutical Sciences of Shandong University，250012）

Objective：To determine the combined dynamic antifungal effects of fluconazole and the tested antibacterial agents and evaluate the impact of the tested antibacterial agents on fluconazole penetration through biofilm. Methods：The dynamic killing curve was obtained based on the combined drugs against Candida albicans using viable bacterial counting method.The biofilm penetration test was evaluated by“sandwich”experimental method.Results：Synergistic effects on fluconazole were showed by using the tested antibacterial agents.The penetrating ability of fluconazole through biofilm by the drug resistant Candida albicans varied by different tested antibacterial drugs，of which minocycline and rifampicin shown strongest impact on it but also on the synergistic effects of dynamic antifungal action.Levofloxacin，azithromycin and others had a lower impact.Conclusion：The tested antibacterial agents can promote the fluconazole penetration of Candida albican’s biofilm and increase fluconazole’s dynamic antifungal effect.

Fluconazole；Candida albican；Antibacterial Agents；Combined Antifungal Effect

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.04.002

2013-8-21）

山东省自然基金、攻关课题（ZR2011HL049，2013GSF11848）

杨久丽，女，主管药师。研究方向：抗菌药物合理应用。

孙淑娟，女，博士，主任药师，硕士生导师。研究方向：抗真菌耐药方法与机制研究。通讯作者E-mail：sunshujuan888@163.com