藤梨根提取物对人胃癌BGC细胞凋亡及Bax蛋白表达的影响

郭 洁，王小平，白吉庆

(陕西中医学院，陕西 咸阳 712046)



藤梨根提取物对人胃癌BGC细胞凋亡及Bax蛋白表达的影响

郭 洁，王小平，白吉庆

(陕西中医学院，陕西 咸阳 712046)

目的：探讨藤梨根提取物对人胃癌BGC-823细胞凋亡的影响及其调控机制。方法：体外培养对数生长期胃癌BGC-823细胞，采用不同浓度的藤梨根提取物作用于人胃癌BGC-823细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡，采用免疫组织化学方法检测Bax蛋白表达。结果：藤梨根作用于BGC-823，在8～32mg·mL-1时呈不同程度的促进凋亡；藤梨根提取物大、中、小剂量组对人胃癌BGC-823细胞中Bax表达水平上调。结论：藤梨根提取物对人胃癌BGC-823细胞的增殖具有明显抑制作用，在实验浓度范围内呈浓度依赖性促进细胞凋亡，这可能与激活 Bax 蛋白表达有关。

藤梨根；人胃癌BGC细胞；Bax蛋白

胃癌是我国最常见的肿瘤之一，其死亡人数在我国居恶性肿瘤的首位[1]。藤梨根为猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidialindi)软枣猕猴桃(Actinidiaarguta(Sieb. et Zucc.)Planch的根[2]。现代药理研究表明：藤梨根具有抗肿瘤、调节免疫等作用，可用于治疗消化系统癌症等症[3-4]。本实验采用藤梨根乙酸乙酯提取物，经初步实验，对人胃腺癌SGC-7901细胞有较好的抗瘤效果。为了进一步验证藤梨根提取物的抗胃癌效果，本实验研究藤梨根提取物对人胃癌BGC-823细胞凋亡及其部分作用机制，为临床应用研究提供相关实验依据。

1 材料

人胃癌 BGC-823细胞株(陕西中医学院病理学实验室)，RPMI 1640 培养基(购自GIBCO公司)，小牛血清(Hyclone公司)，Bax一抗(北京中杉金桥生物技术有限公司提供)，SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司提供)，DAB试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司提供)。Ep-ics XL流式细胞仪(美国Beckmon-Coulter公司)。荧光酶标仪(TECAN公司)，低温高速离心机(TGL-16G型上海医用分析仪器厂)。

2 方法

2.1 细胞培养

胃癌细胞株 BGC-823培养于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液，置 37℃、5%CO2培养箱中培养，每天换液。待细胞生长密度80%以上时，以0.25%胰蛋白酶消化，传代。

2.2 MTT法检测细胞增殖水平

取对数增长的BGC-823 细胞制成1× 105个/mL的细胞悬液，每孔加入 150μL，给不同浓度(8，16，32mg/mL)的药物30μL/孔，每个浓度重复3个孔，置CO2培养箱内培养，分别在24h、48h、72h测一次指标，检测前4h加入5mg/mL MTT贮存液25μL/孔，于37℃、5%CO2培养箱中孵育。用自动酶标读数仪在570nm波长处测定每孔吸光度(A)值。计算细胞生长抑制率(GI)，GI=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。重复实验5次。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡水平

取6 孔板，接种培养细胞，置37℃、5%CO2温箱培养，培养至细胞生长密度为80%以上，加无血清培养基，置37℃、5% CO2温箱继续培养24h，加入药物，使各组藤梨根提取物的浓度为 0、16、32mg/mL。置37℃、5% CO2温箱继续培养24h。PBS液洗涤，调整细胞浓度约为1×105个/mL。每个浓度药物各取1mL细胞置于EP管中，每管1mL细胞，离心5min，弃上清液，每管加入1mL PBS，使细胞悬浮，离心5min，弃上清液；重复步骤，PBS弃净，将细胞重悬于200μL Buffer，每管加入10μL Annexin V-FITC混匀，避光反应15min，每管加入300μL Buffer。上机前5min加入10μL碘化乙啶(PI)染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.4 Bax蛋白表达水平检测

将对数生长期BGC-823细胞接种于12孔板内，按组加入相应浓度的药物24h后取出，按照试剂盒使用说明检测Bax蛋白表达水平。

3 结果

MTT 法检测细胞增殖的影响。不同浓度的藤梨根提取物作用于人胃癌BGC-823细胞12h后，对细胞增殖均有不同程度抑制。MTT 法检测结果显示，当藤梨根提取物浓度为8mg/mL时，对胃癌细胞增殖的抑制率为20.95%；浓度为16mg/mL，对胃癌细胞增殖的抑制率明显增强，为25.63%；当浓度为32mg/mL时，对人胃癌 BGC-823 细胞的增殖抑制率达到 53.19%。

对人胃癌 BGC-823 细胞凋亡水平的影响。本实验设空白对照和3个藤梨根提取物组，结果表明，藤梨根提取物浓度在16mg/mL、32mg/mL时能够显著诱导胃癌细胞的凋亡。浓度为16mg/mL时，凋亡细胞最多，浓度为32mg/mL时，死亡细胞迅速增多。见表1。

16mg/mL藤梨根提取物处理12h后，免疫组化检测胃癌BGC-823细胞Bax的蛋白表达水平，与对照组相比，藤梨根提取物预处理可明显增加细胞内Bax蛋白表达水平。见表2。

表1 流式细胞术检测BGC-823坏死、正常和凋亡细胞比例变化

注：与空白对照组比较，**P<0.01。

表2 藤梨根对胃癌BGC-823细胞Bax基因蛋白表达的影响

注：与阴性对照组比较，**P<0.01。

3 讨论

本实验中，我们通过免疫组化的方法证实了藤梨根预处理可以有效增加Bax表达水平，与此同时降低胃癌SGC-7901细胞中P53和Bcl-2的表达[5-6]，这些结果表明，藤梨根促进胃癌细胞凋亡的细胞机制可能与Bax、P53和Bcl-2的表达密切相关，为了进一步探索藤梨根提取物的抗肿瘤作用及其机理，我们还需进一步研究，确定其抑制肿瘤生长的有效剂量。本研究的开展有利于指导今后藤梨根的临床用药。

[1] 胡家露,樊代明.内科学[M].北京:高等教育出版社,2001:557．

[2] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草(第三册,第九卷)[M].上海:上海科学技术出版社,1999:536-537.

[3] 南京药学院《中草药学》编写组.中草药学(中册)[M].南京:江苏人民出版社,1976:662-623.

[4] 薛瑞，王小平． 藤梨根提取物对裸鼠移植瘤的抑制作用研究[J]．陕西中医，2008，29(5):362-363．

[5] 王小平， 白吉庆， 叶峥嵘. 藤梨根提取物对裸鼠移植人胃癌SGC-7901细胞瘤p53基因蛋白的影响[J].现代中医药,2012,32(1):56-57.

[6] 白吉庆 ，王小平，叶峥嵘. 藤梨根提取物对人胃癌SGC-7901细胞凋亡及Bcl2的影响[J].陕西中医学院学报,2012,35(1):59-61.

(责任编辑：宋勇刚)

The Effects of Kiwi Root Extract on Human Gastric Cancer BGC Cell Apoptosis and Bax Protein Expression

Guo Jie, Wang Xiaoping, Bai Jiqing

(Shanxi College of Traditional Chinese Medicine， Shanxi 712046,China)

Objective:To discuss the effects of Kiwi root extract on human gastric cancer BGC cell apoptosis and its regulatory mechanism. Methods:The gastric cancer BGC-823 cells in logarithmic phase were cultivated in vitro.Kiwi root extract with different concentrations act on gastric cancer BGC-823 cells. The cell apoptosis was detected by Flow cytometry instrument, and Bax protein expression was tested by immunohistochemical methods. Results:Kiwi root can act on BGC-823 cells. Kiwi root in 8～32 mgoml-1can promote cell apoptosis in the different level. Kiwi root extract raised Bax expression levels of human gastric cancer BGC-823 cells in large dose group, medium dose group or small dose group. Conclusion:Kiwi root extract has obvious inhibitory effect on human gastric cancer BGC-823 cells proliferation. Kiwi root extract in the experimental concentration range can promote cell apoptosis in concentration dependence, which may be related to activation of Bax protein expression.

Kiwi Root;Human Gastric Cancer BGC Cell Apoptosis；Bax Protein

2014-02-21

陕西省教育厅资助项目(08JK266);陕西省科技厅中药现代化资助项目[(2009K19-03(2);2010K17-02)]

郭洁 (1980-)，女，陕西中医学院讲师，研究方向为中药及复方药理作用。

R285.6

A

1673-2197(2014)13-0012-02