喷雾冷冻干燥对家蝇幼虫活性成分抗菌及抗炎活性影响

褚夫江，刘文彬，朱家勇*

(1.广东省生物活性药物研究重点实验室，广东 广州510006；2.广东药学院 基础学院，广东 广州 510006)



喷雾冷冻干燥对家蝇幼虫活性成分抗菌及抗炎活性影响

褚夫江1,2，刘文彬1,2，朱家勇1,2*

(1.广东省生物活性药物研究重点实验室，广东 广州510006；2.广东药学院 基础学院，广东 广州 510006)

以人工饲养繁殖的家蝇(Musca)3龄幼虫为材料，探讨喷雾冷冻干燥对家蝇幼虫活性提取物抗菌及抗炎活性的影响。结果表明，经喷雾冷冻干燥处理的家蝇幼虫活性提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌具有有效抑制作用；对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子TNF-α和IL-6表达具有明显的抑制作用。

家蝇幼虫；喷雾冷冻干燥；冷冻干燥；抗菌；抗炎

家蝇隶属昆虫纲(Insecta)双翅目(Diptera)环裂亚目(Cyclorrhapha)蝇科(Muscidae)家蝇属(Musca)。其幼虫蝇蛆含有丰富的蛋白质、氨基酸、脂肪酸、甲壳素 、维生素、矿物元素和抗菌肽等多种活性物质[1]，是一种非常重要的昆虫资源，其所特有的抗菌[2]及抗炎[3]活性逐渐引起研究者的重视。随着蝇蛆养殖规模逐渐扩大，工厂化养殖为蝇蛆资源的利用奠定了充分的原料基础。目前，关于蝇蛆的研究开发利用还处于初级阶段，特别是在医药领域中的应用还有待进一步开发，而有效减少加工过程中蝇蛆体内药用成分的活性缺失成为蝇蛆资源开发的重点。

在前期的研究中，我们比较了传统炮制和现代加工方法对蝇蛆抗菌及抗炎活性的影响，结果表明现代加工工艺能够有效保护蝇蛆中抗菌及抗炎物质的活性[4]。真空冷冻干燥(freeze drying，FD)能有效减少活性缺失，但是此法所需干燥时间长、耗能高，不能满足规模化生产的需要。因此，有必要寻求一种更快速的样品干燥方法。

喷雾冷冻干燥(spray freeze drying， SFD)是近年发展起来的新型干燥技术，其结合了喷雾干燥和冷冻干燥两项技术优点[5]。干燥后的物料为粉状固体，产品原有的生物、化学特性基本不变，易于长期保存，特别适用于热敏性、黏稠性、活性物料及含糖量高的产品的低温干燥。本实验以实验室人工饲养的家蝇3龄幼虫为原料，经组织匀浆、过滤、离心及超滤离心进行活性成分的提取，采用冷冻干燥及喷雾冷冻干燥技术进行活性成分的制备，研究不同方法所获产品含水量及体外抗菌、抗炎活性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大肠埃希菌(Escherichia coli)ACCC01309、金黄色葡萄球菌(Staphylococus aureus)ATCC 25923为本实验室保存。细胞株为鼠源巨噬细胞(Macrophage, Mφ) RAW264.7，购于中山大学细胞与动物实验中心。种蝇获赠于广东省疾病预防与控制中心，双翅目(Diptera)，蝇科(Muscidae)，蝇属(Musca)，家蝇(M.domestica)，实验室自行繁育获得家蝇3龄幼虫。笼养方式饲养成蝇，成蝇交配、产卵、孵化，发育为幼虫，待幼虫成长为3龄幼虫后，采用冷热刺激的方式进行诱导富集小分子活性成分，收集幼虫待用。

1.2 工艺流程

3龄幼虫经组织匀浆，过40目纱网，12 000r/min离心10min，收集上清，依次用截留分子量为100KD及30KD超滤膜进行超滤，收集滤液后进行冷冻干燥及喷雾冷冻干燥。

1.3 冷冻干燥制备家蝇幼虫活性成分

准确量取400.00mL超滤截留液，于-80℃冰箱中速冻3h，转移至多歧管式真空冷冻干燥器中进行干燥，条件：冷阱温度-60℃、真空度20Pa、干燥时间20h。干燥结束后，收集产品，准确称量，获得产品1，实验重复3次。

1.4 喷雾冷冻干燥制备家蝇幼虫活性成分

准确量取400.00mL超滤截留液，检查仪器气密性，待仪表显示稳定10min后，设定条件：冷阱温度-60℃、真空度20Pa、物料温度-25℃、运行时间8h。干燥结束后，收集产品，准确称量，获得产品2，重复实验3次。

1.5 含水量测定

方法参照国家药典2010版附录ⅨH水分测定法第一法(烘干法)进行。取供试品2.5g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5mm；疏松供试品不超过10mm ；精密称定，打开瓶盖在100～105℃干燥5h，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30min，精密称定，再在上述温度干燥1h，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量(%)，重复实验3次。

1.6 抗菌活性检测

取无菌96孔板，每孔加入浓度为1×106CFU/mL菌液100μL，再分别加入相应浓度的产品1和2 (倍比稀释：200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.12mg/mL、1.56mg/mL、0.78mg/mL、0.39mg/mL)，同时设立阴性对照组(蒸馏水)、空白组(无细菌)，37℃培养16～20h。每孔加入5μL0.5%氯化三苯四氮唑，37℃培养至无药物对照组变红色时终止培养，有细菌生长的孔显红色，无细菌生长则不显色。试验组无菌生长的最小稀释度所对应的浓度为最小抑菌浓度(MIC)。将上述未显色的孔各取培养的混合物100μL，涂布于LB固体平板上，37℃培养过夜，菌落数小于5个的平板对应的浓度为最小杀菌浓度(MBC)。

1.7 抗炎活性检测

巨噬细胞RAW264.7按照1×106cell/mL接种于6孔板，培养24h后，更换为无血清培养基。进行分组处理：正常对照组、LPS处理组(100ng/mLLPS)、实验处理组[不同浓度的产品1和2：高剂量组(100μg/mL)、中剂量组(40μg/mL)、低剂量组(10μg/mL)+100ng/mLLPS]。各组细胞在不同处理因素作用24h后，收集培养液上清，参照TNF-α、IL-6检测试剂盒说明书，在酶标仪上测定450nm吸光度，并根据标准曲线计算相应的浓度。

1.8 数据分析与统计

2 结果

2.1 不同干燥方法对产品含水量的影响

经精确称量，产品1的质量为(3.157±0.115)g，产品2的质量为(3.078±0.073)g。影响产品含水量的主要因素为干燥原理和温度等因素，经测定产品1的含水量为(3.45±0.98)%，产品2的含水量为(2.14±0.42)%，两种干燥方法所获产品的含水量均小于5%。

2.2 不同干燥方法对产品抗菌活性的影响

以常见代表性的革兰氏阳性菌(G+)金黄色葡萄球菌及革兰氏阴性菌(G-)大肠埃希菌作为试验菌，采用微量肉汤稀释法测定产品1和产品2对这些菌株的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)。结果显示，产品1和产品2对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均具有一定的抑制作用，其中，相对产品1，产品2对大肠埃希菌的抑制作用更为显著。见表1。

表1 不同干燥方法对家蝇幼虫活性成分抑菌活性的影响

2.3 不同干燥方法对产品抗炎活性的影响

相对LPS处理组，产品1和产品2均能有效抑制巨噬细胞TNF-α、IL-6的表达，且抑制效果具有一定的剂量依赖性。在同等剂量条件下，产品2能够更显著地降低TNF-α、IL-6水平。相对阴性对照组，在低剂量条件下，产品2对TNF-α的降低效率达20%以上，而产品1则降低12%左右；高剂量条件下，产品2对TNF-α的降低效率达70%以上，产品1则降低67%左右。产品1和产品2对IL-6表达的影响也具有同样的趋势。见表2。

3 讨论

蝇蛆的药用价值主要集中在蝇蛆体内免疫活性物质的开发。研究表明，蝇蛆能分泌多种抗菌活性物质，具有抑菌、促进伤口愈合及杀伤癌细胞等功能[6]。前期研究发现，家蝇幼虫体内的小分子活性成分具有改善动物动脉粥样硬化，减轻炎症反应的作用[7-8]。而如何在放大生产过程中最大限度地保持家蝇幼虫有效成分的活性成为蝇蛆资源开发的关键。为此，我们就冷冻喷雾干燥对蝇蛆活性成分抗炎及抗菌活性的影响进行了初步研究。

表2 不同干燥方法对家蝇幼虫活性成分抗炎活性的影响 ±s，n=6)

注：与本产品阴性对照组比较，##P< 0.01 ；与产品1对应剂量组比较，**P< 0.01。

含水量是检验干燥效果的重要指标之一。结果表明，冷冻干燥和喷雾冷冻干燥均能有效去除产品中的水分，且含水量均在5%以下，其中喷雾冷冻干燥所获产品的含水量低于冷冻干燥所获产品，主要原因是喷雾冷冻干燥增大了干燥面积，能够更有效地提高干燥效率[9]。有效去除产品中的水分后，产品的活性有何影响呢？我们就两种方法所获产品的抗菌及抗炎活性进行了比较，结果显示，两种方法所获产品对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均具有一定的抑制作用。其中，喷雾冷冻干燥方法所获产品对大肠埃希菌的抑制作用更为显著；两种方法所获产品均具有明显抗炎效果，其中喷雾冷冻干燥所获产品的抗炎作用更显著。在针对不同干燥方法对葛仙米藻蛋白抗氧化特性影响的研究中，也同样证实喷雾冷冻干燥能够更好地保持提取物的活性[10]。

综上所述，喷雾冷冻干燥能够有效去除家蝇幼虫活性成分中的水分，同时能有效保持活性成分的抗菌及抗炎活性，是一种可用于规模化开发蝇蛆资源的理想干燥技术。

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(责任编辑：宋勇刚)

Effects of Spray Freeze Drying on Antibacterial and Anti-inflammatory Activity of Housefly Larvae

Chu Fujiang1,2,Liu Wen bin1,2,Zhu Jiayong1,2*

(1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances, Guangzhou 510006, China; 2.School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China)

Three instar larvae of housefly (Musca) which harvested by captive breeding was taken as raw materials. The effects of spray freeze drying on antibacterial and anti-inflammatory activity of housefly larvae were investigated. And the results showed that the extract of housefly larvae which was treated by spray freeze drying had the function of inhibiting the Staphylococcus aureus and Escherichia coli. And also the expression of TNF-α and IL-6 of macrophage which induced by LPS were inhibited when treated with the extract of housefly larvae.

Housefly Larvae; Spray Freeze Drying; Freeze Drying; Antibacterial; Anti-inflammatory

2014-03-17

国家自然科学基金项目(81274061)；广东省战略性新兴产业核心技术攻关项目(2012A080800016)；广东省医学科研基金项目(B2013189)；广东省自然科学基金(S2013040014444)；广东省高等学校学科与专业建设专项资金项目(2013LYM0045)

褚夫江(1980-)，男，博士，广东省生物活性药物研究重点实验室助理研究员，研究方向为生物活性药物的结构与功能。

朱家勇(1954-)，男，广东药学院教授，研究方向为生物活性药物的结构与功能。

R282.74

A

1673-2197(2014)13-0006-03