微量血痕中18SrRNA与ACTBmRNA变化的时间规律性研究

单 迪 郑吉龙 任 鹏 李 军

（中国刑警学院 辽宁 沈阳 110035）

微量血痕中18SrRNA与ACTBmRNA变化的时间规律性研究

单 迪 郑吉龙 任 鹏 李 军

（中国刑警学院 辽宁 沈阳 110035）

制备不同时间的血痕样品，采用实时定量PCR检测不同时间点18SrRNA和ACTB mRNA含量，并进行统计学分析。结果发现在10周内，随血痕经过时间延长，18SrRNA基因片段和ACTBmRNA基因片段发生了较明显降解，具有一定的时间规律性。18SrRNA基因片段较ACTB mRNA降解速度快。采用实时定量PCR技术检测18SrRNA和ACTBmRNA含量变化，为推断血痕经过时间提供了新的方法和客观依据。

实时定量PCR 血痕形成时间 18SrRNA ACTB 降解

血痕作为犯罪现场最常见的物证，其形成时间往往与犯罪发生时间密切相关。血痕经过时间的研究国内外均有报道，这也一直是法医学界尤其是法医病理学研究的重点和热点。本实验采用实时定量PCR的实验技术对血痕中的18SrRNA与ACTBmRNA变化进行定量检测，以探索用实时定量PCR推断血痕经过时间的可行性方法。

1 材料和方法

1.1 检测血样的制备

选取健康成年男性、女性各20名（年龄在18～20岁之间）的静脉血，分别滴于载玻片上，每张载玻片滴5μL，制作成血痕，置室内环境(不遮蔽光线)。除1个对照组于取血后即刻取材外，其余以放置时间不同，随机分为8个实验组，即分别放置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周组，每组20张玻片。实验期间室内环境变化不加以人为控制，每周监测并记录室内温、湿度具体变化情况。

1.2 模板DNA的提取、纯化

采用手术刀片将载玻片上制备的待检血痕刮下，收集到1.5mL EP管中。每个样品管加500μL裂解液，离心2000～3000rpm，30s，加入10μL蛋白酶K（10mg/mL）。样品室温孵育40min，中间轻轻震荡，肉眼观察到其成茶色，50℃孵育40min，中间每管追加10μL蛋白酶K。孵育过程中轻轻震荡混匀，至肉眼观血渣全部溶解。将样品放入70℃加热器上裂解35min，中间轻轻震荡混匀。每个样品加入磁珠30μL震荡血样、裂解液和磁珠的混合液，使其充分接触反应8min。将样品高速震荡后，快速放置到磁力架上，静置1～2min，可观察到磁珠立刻吸附到管壁靠近磁力架的一侧，用移液器小心吸弃管中液体，中间注意不要震动磁珠。每个样品管加入裂解液300μL，高速震荡，洗涤磁珠，洗涤1～2min后将管放到磁力架上，待磁珠吸附到一侧管壁后，用移液器小心吸弃管内液体。此步重复2次，共洗涤3次。第3次洗液洗涤后，将样品管管盖打开，室温挥发管内残存液体，持续时间5～20min。每管加入溶解液350μL，将样品管放到65℃加热块上，反应8～10min，洗脱磁珠吸附的DNA。震荡混匀磁珠与洗脱液的混合液，将样品管放到磁力架上，用移液器将洗脱液转移到标记好的新EP管中。

1.3 实时定量PCR检测

1.3.1 引物和探针设计合成

引物和探针为AB公司设计合成，引物序列和探针结合序列详见表。

表 待检基因位点18SRNA与ACTB的引物序列和探针结合序列

1.3.2 real time PCR实验方法

Stage1∶AmpErase UNG活化。50.0℃ 2min，Ramp Rate∶Auto，Reps∶1。

Stage2：AmpliTaq Gold DNA聚合酶活化95.0℃10min，Ramp Rate∶Auto，Reps∶1。

Stage3：PCR扩增（共40个循环） 95.0℃ 15s (溶解)，60℃ 1min(退火／延伸)，Reps∶40。

1.4 数据检测与分析

反应结束后，进入 result窗口的扩增曲线（amplification plot）页面，选择自动分析（Auto Ct），查看自动分析的实验图谱。此次反应所有标准品点几乎落在一条直线上，此次绝对定量的数据结果可信。同时采用用EXCEL软件对18SrRNA和ACTB mRNA随着时间的延长的参数值变化规律进行统计学分析，做线性回归，得出相关系数，获得回归方程。

2 结果

2.1 18SrRNA基因位点随时间降解变化

在10周的时间范围内，一定的环境条件下，血痕中的18SrRNA的相对含量随时间延长而逐渐下降。第10周时几乎检测不到血痕中的18SrRNA的相对含量。

2.2 ACTB基因位点随时间降解变化趋势

ACTB降解变化趋势：ACTB基因位点的降解变化基本同18SrRNA基因位点相同。

2.3 人血痕经过时间与18SrRNA相对含量的变化趋势回归分析

在10周的时间范围内，一定的环境条件下，血痕中的18SrRNA的相对含量随时间延长而逐渐下降。第10周时几乎检测不到血痕中的18SrRNA的相对含量。经EXCEL软件相关分析，女性和男性18SrRNA的相对含量与时间决定系数（R2）分别为为0.903和0.9374，18SrRNA的相对含量随着时间的延长而呈下降趋势，两者之间存在着较强的负相关，18SrRNA的相对含量与时间具有密切相关关系，回归方程见图1、图2。

图1 20名女性血痕经过与18SrRNA相对含量的变化趋势回归分析

图2 20名男性血痕经过时间与18SrRNA相对含量的变化趋势回归分析

2.4 人血痕经过时间与ACTBmRNA相对含量的变化趋势回归分析

在10周的时间范围内，一定的环境条件下，血痕中的ACTBmRNA的相对含量随时间延长而逐渐下降，其下降趋势与 18SrmRNA基本相同，但18SrRNA基因片段较ACTBmRNA基因片段降解速度快。第10周时几乎检测不到血痕中的ACTBRNA的相对含量。经EXCEL软件相关分析，女性和男性ACTBmRNA的相对含量与时间决定系数（R2）分别为0.8285和0.7603，ACTBmRNA的相对含量随着时间的延长而呈下降趋势，两者之间存在着较强的负相关，ACTBmRNA的相对含量与时间具有密切相关关系，回归方程见图3、图4。

图3 20名女性血痕经过时间与ACTBmRNA相对含量的变化趋势回归分析

图4 20名男性血痕经过时间与ACTBmRNA相对含量的变化趋势回归分析

3 讨论

2002年至今，国内外学者陆续报道了使用流式细胞仪、计算机图像技术检测组织细胞中DNA降解变化推断细胞离体时间的方法，但存在DNA降解检测灵敏度低、准确率低，在不同的实验室实验数据重复性差、研究时间范围局限在一周内等缺点。按照理论假设，不同体积的血痕中DNA总量不同，但18SrRNA基因位点与ACTB基因位点的相对含量应该是稳定的，因而可以应用检测二者Ct比值变化推测血痕形成时间。本研究使用反转录实时定量PCR的方法检测10周内血痕，发现随血痕经过时间的延长，RNA总量逐渐降解，18SrRNA相对于β-actin mRNA含量随时间延长逐渐下降。提示本研究利用实时定量PCR检测方法具有灵敏度高、精确性高的优点，能够检测出微量DNA检材并且精确的检测出其含量，因而可以对较长时间降解程度较严重的血痕DNA进行定量分析，从而拓宽了时间推断范围。

本研究表明在10周内，一定的环境条件下，血痕中18SrRNA和β-actinmRNA随时间发生了降解变化。本实验选择的两段特异性DNA片段18SrRNA基因片段和ACTB基因片段随时间的延长均发生了较明显降解，但18SrRNA基因片段较ACTB基因片段降解速度快。18SrRNA和β-actinmRNA是广泛存在于各种真核细胞生物的一类看家基因，其序列功能高度保守且表达数量丰富。18SrRNA在细胞质内含量丰富，一个细胞内有数千拷贝。且几乎是单独存在于由多个小核糖体组成的复杂的核糖体蛋白合成物中，如同DNA分子外表有组蛋白保护。18SrRNA可以隔绝RNA酶和其他化学因子对其自身的侵袭，使得18SrRNA可以在细胞未破损或核糖体未裂解时保持相对稳定。而成熟β-actinmRNA主要也游离在胞质中，含量不如18SrRNA丰富，且容易降解，半衰期短。通过电子显微镜观察，这种多聚结合体并不十分紧密，中间有明显空隙，这样易于受到外界环境干扰，稳定性较差。因此，18SrRNA和β-actinmRNA均为本研究提供了合适的实验样本。

为了更接近实战，本实验并没有严格控制可能影响血痕降解过程的温度、湿度、光照强度等室内环境因素，以求模拟实际案例中室内现场的血痕，并探索在多个条件变量的综合作用下，定量检测到血痕降解变化的可行方法。实验的研究结果标明，该方法可以客观反映现实环境中血痕18SrRNA与ACTB的时间变化规律。当然，无法判断其中任一因素变化，对血痕降解变化的具体影响。今后的研究，可以固定其中多个变量，研究单一变量对血痕降解的影响，获得更系统的数据变化规律，来支持该方法在血痕经过时间推断中理论和实践应用。

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（责任编辑：于 萍）

D913

A

2013-12-26

公安部重点研究计划项目（编号：2011ZDYJXJXY005）。

单迪（1980-），男，辽宁沈阳人，中国刑警学院讲师，硕士，主要从事法医学研究。