肿节风中总黄酮大孔树脂吸附－脱吸附动力学研究

杨晓东

（湖南省怀化市第一人民医院药剂科，湖南 怀化 418000）

肿节风为金粟兰科植物草珊瑚 Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai的干燥全株，具清热凉血、活血消斑、祛风通络等功效，临床上用于治疗肿瘤（晚期胰腺癌、消化系统恶性肿瘤和鼻部恶性肿瘤、白血病等）、细菌性痢疾、骨折及多种口腔疾病，疗效良好[1－2]。酚类、鞣质、黄酮苷、香豆素和内酯等为肿节风的主要成分，其中总黄酮是其抗肿瘤的有效成分之一[3]。肿节风水提取液中总黄酮的初步纯化后，选用大孔树脂进一步纯化，通过静态吸附和动态吸附试验，以总黄酮的比吸附量和解洗脱率为评价指标，进行多种大孔树脂的筛选，最终确定选择HPD－100型大孔树脂。本试验中对总黄酮在HPD－100型大孔树脂上的吸附与脱吸附的动力学过程进行了研究，为确定大孔树脂分离纯化肿节风纯化工艺条件（吸附终点与洗脱终点）提供科学依据。

1 仪器与材料

Lambda Bio 40型紫外分光光度仪；Mettler AE－200型电子分析天平。HPD－100型大孔吸附树脂（沧洲宝恩化工有限公司）；肿节风药材（湖南三湘中药饮片有限公司）；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号为100080－200707）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 树脂预处理

HPD－100湿法装柱，在树脂柱内加入高于树脂层10 cm的乙醇，浸泡4 h后，放出浸液，以乙醇洗脱，至洗涤液在试管中加水稀释不浑浊且用紫外光谱扫描不得检出吸收峰为止，再用水洗涤至无醇味，备用。

2.2 溶液制备

取肿节风适量，加14倍量水，煎提2.5 h，滤过；滤渣加12倍量水，煎提2 h，滤过，合并滤液；80℃以下减压浓缩至提取液含生药0.6 g/mL，加入乙醇使药液含醇浓度达50%，静置24 h，滤过，回收乙醇，浓缩至提取液含生药0.6 g/mL，即得供试品溶液。精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品53.3 mg，置25 mL容量瓶中，加无水乙醇20 mL，置水浴上微热使溶解，放冷，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取2.5 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释，使乙醇浓度为70%，即得每1 mL中含无水芦丁0.213 mg的对照品溶液。

2.3 标准曲线绘制

精密吸取质量浓度为0.213 g/L的芦丁对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分别置 25 mL 容量瓶中，各加甲醇至6.0 mL，加 5%亚硝酸钠溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min，加 10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，取10 mL，以2 000 r/min的速率离心3 min，放置12 min。按2005年版《中国药典（一部）》附录ⅤB中分光光度法，在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，回归方程为 Y＝2.013 X －0.013，r＝0.999 9(n＝6)。结果表明，芦丁进样量在 0.213 ～1.278 mg范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.4 总黄酮含量测定

精密量取2.2项下供试品溶液适量，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另各取相同量上述供试品溶液，置25 mL容量瓶中，不加显色剂，直接加水至刻度，摇匀，作为空白对照品溶液。分别取上述供试品溶液、空白对照品溶液适量，在490 nm波长条件下测定其紫外吸收度。

2.5 动态吸附动力学试验

取2.2项下供试品溶液适量，以2 BV/h的流速通过装有5.6 g HPD －100型湿树脂的玻璃柱（内径 1 cm），每 1 BV（10 mL）流出液收集1份，按上述方法测定各份流出液中总黄酮的含量，并根据上柱前药液的含量计算各份流出液中总黄酮的泄漏率。结果见表1。以流出液的份数（BV/份）为横坐标、总黄酮的泄漏率（%）为纵坐标，绘制总黄酮在HPD－100型树脂柱上的泄漏曲线，见图1。

表1 总黄酮在HPD－100型树脂柱上的泄漏率

图1 总黄酮在HPD－100型树脂上的泄漏曲线

2.6 动态脱吸附动力学试验

取上述动态吸附动力学试验中已吸附饱和的HPD－100型树脂柱，先用4 BV的蒸馏水洗柱，再用50%乙醇溶液以8 BV/h流速进行洗脱，每1 BV流出液收集1份，同上测定各份流出液中总黄酮的含量，见表2。以洗脱液的份数为横坐标、总黄酮的相对浓度（洗脱液中总黄酮浓度占上样前药液浓度的比值）为纵坐标，绘制总黄酮在HPD－100型树脂柱上的洗脱曲线，结果见图2。

表2 各流份洗脱液中总黄酮的含量

图2 总黄酮在HPD－100型树脂上的洗脱曲线

3 讨论

预试验中，对水提取液经过初步纯化与不经过初步纯化的大孔树脂吸附分离纯化进行了对比考察，结果发现，水提液经过初步纯化后再上大孔树脂进行吸附分离，总黄酮提取物的纯度明显提高，大孔树脂的使用周期也明显提高。因此，对水提液的初步纯化有利于提高大孔树脂吸附分离的效果，延长大孔树脂的使用周期，有利于大孔树脂的再生。

笔者通过静态吸附和动态吸附试验，以总黄酮的比吸附量和解洗脱率为评价指标，选用 PHD100，D －101，LSA －7，LSA －10，LSA－30，ADS－17，ADS－21，ADS－F8等8种树脂进行了筛选，通过对比上述评价指标，并以总黄酮比吸附量和解洗脱率为纵坐标、药液浓度为横坐标绘制动态吸附和洗脱等温曲线图，最终确定选择HPD－100型大孔树脂。动态吸附动力学试验结果显示，肿节风提取液中总黄酮在HPD－100型树脂上泄漏损失10%左右时，上样的药液体积约为 2 BV（即 20 mL），测定试验所用HPD－100型树脂的水分为64.2%，通过计算得每克 HPD－100型干树脂约吸附10 mL。因此，可确定肿节风提取液以生药量计质量浓度为0.6 g/mL时，在HPD－100型树脂柱上的吸附终点为流出液达2 BV左右。另外，由动态脱吸附动力学试验结果可知，在以50%乙醇为洗脱溶剂的情况下，洗脱液为5 BV时，肿节风提取液中总黄酮已基本洗脱完全，故可以此作为洗脱的终点。

大孔树脂吸附法近年来已广泛应用于各种植物和草药的黄酮类分离纯化。黄酮类化合物一般多具有酚羟基和糖苷链，有一定的极性和亲水性、生成氢键的能力较强，有利于弱极性和极性树脂的吸附。但在某些情况下吸附作用力强，解吸却相当困难，所以选择树脂种类需综合考虑吸附率、吸附速率、解吸率和产物得率及其黄酮含量等多方面因素[4－6]。

综上所述，采用大孔树脂动态吸附与脱吸附动力学研究，对肿节风提取液中有效部位在大孔树脂上的分离纯化过程进行有效控制，可为确定肿节风提取液在大孔吸附树脂分离纯化工艺的吸附终点与洗脱终点提供科学合理的依据。

参考文献:

[1]徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学（第二版）[M].北京:人民卫生出版社，1991:1 424.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京:中国医药科技出版社，2010:207.

[3]林 剑.草珊瑚中总黄酮甙对小鼠荷瘤的恢复作用[J].北京大学学报:自然科学版，1981（2）:80 －82.

[4]陈菁菁，李向荣，方 晓.大孔吸附树脂分离纯化桑叶总黄酮及其动力学研究[J].浙江大学学报，2006，35（2）:119 －223.

[5]郄冰冰，王 璐，郭瑞锋，等.大孔吸附树脂分离纯化荷叶提取物[J].中国药业，2007，16（20）:44 －45.

[6]李 瑶，齐晓丽，孟祥颖，等.竹叶中黄酮提取纯化工艺研究[J].东北师大学报:自然科学版，2006，38（1）:92 －95.