均匀设计法优化白藜芦醇超临界CO2流体萃取工艺

方耀平，秦郁文，唐富丽，董自亮

（1.太极集团西南药业股份有限公司，重庆 400038； 2.太极集团重庆涪陵制药厂有限公司，重庆 408000）

白藜芦醇为一类多酚类物质，存在于虎杖、葡萄、花生等植物中，并以虎杖中的含量最高。白藜芦醇具有广泛的生物学活性和药理作用，如诱导肿瘤细胞的凋亡[1－2]、抗菌[3]、抗心肌炎[4]以及免疫调节[5]等。此外，白藜芦醇还具有抗辐射诱变损伤、抗衰老等作用，在食品、保健品、化妆品等领域也具有广泛的应用价值。目前从虎杖中提取白藜芦醇的方法多为有机溶剂提取，利用白藜芦醇易溶于极性有机溶剂的性质，将其从原料中提取出来。但是，有机溶剂提取的粗品中含有大量的植物多糖、黄酮类化合物、色素、酚酸类等多种杂质，不利于后续工序的精制纯化，且工序多、工艺烦琐复杂；加热时间长，使成品颜色加深，产品易氧化变质，稳定性差；有效成分收率较低；有机溶剂耗用量大，会造成严重的环境污染等问题[6]。超临界流体萃取是近几年发展起来的一项分离技术，具有无毒、无残留溶剂、CO2可循环使用等优点，适合于不稳定天然产物和生理活性物质的分离与精制，已成为医药、食品和香料等深加工领域中获得高品质产品的最有效手段之一[7]。目前，利用超临界流体技术萃取虎杖中白藜芦醇的报道尚不多见。为此，本试验中对采用超临界CO2萃取技术，采用均匀设计法，对从虎杖中萃取分离白藜芦醇的工艺进行了研究。

1 仪器与试药

岛津SPD－20A型高效液相色谱仪（LC－20AT）；BP2110型电子天平（德国赛多利斯公司）；SHB－3型循环水式真空泵（郑州杜甫仪器厂）；R－205型旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）；DJ－005型多功能粉碎机（山东精诚医药装备制造有限公司）；HA221－50－06型超临界萃取装置（江苏南通华安超临界萃取有限公司）。虎杖萃取物(批号为120806，自制)，白藜芦醇对照品（中国药品生物制品检定所，批号为111535－200703）；乙腈、甲醇为色谱级，水为纯蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 白藜芦醇含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱:Kromasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相:水 －乙腈（78 ∶22）；检测波长:303 nm；流速:1.0 mL /min；柱温:25 ℃；进样量:10 μL。色谱峰见图 1。

图1 高效液相色谱图

2.1.2 溶液制备

精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的白藜芦醇对照品3.14 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液（0.062 8 g/L）。精密量取对照品贮备液 1 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得白藜芦醇对照品溶液(每1 mL含白藜芦醇6.28 μg)。取虎杖萃取物4 g，精密称定，研细，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞称定质量，超声处理（功率 250 W，频率 40 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，静置后精密量取上清液20 mL，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察:分别精密吸取对照品溶液 2，4，8，12，16，20 μL，注入高效液相色谱仪，依法测定，以白藜芦醇进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，作线性回归，得回归方程 Y＝334 331 X －348.6，R2＝0.999 8（n＝7）。结果表明，白藜芦醇进样量在0.012 55～0.125 6 μg范围内与面积呈良好线性关系。

精密度试验:取白藜芦醇对照品溶液，依法连续测定6次，测定峰面积。结果的 RSD为0.61%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验:取同一批虎杖萃取物（批号为120806）样品6份，按依法制备供试品溶液并测定。结果白藜芦醇的平均含量为6.644 mg/g，RSD 为 1.23%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，室温密闭放置，分别于制备后 0，2，4，8，12，24 h 时进样测定白藜芦醇峰面积。结果的 RSD 为2.25%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验:取已知含量的样品约2 g，共9份，依法制备供试品溶液并定容至200 mL，各取1 mL，分别加入定量的对照品溶液（质量浓度为 6.28 μg /mL）2.0，2.5，3.0 mL（约相当于样品量得80%，100%，120%）各3份，分别按拟订色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。

表1 虎杖萃取物中白藜芦醇加样回收试验结果（n＝9）

2.2 超临界CO2萃取工艺条件筛选

2.2.1 均匀设计试验

采用均匀设计试验优化超临界－CO2萃取工艺参数。结合文献[8]及预试验结果，确定主要考察因素为萃取压力（X1）、萃取时间（X2）、萃取温度（X3）、夹带剂（95% 乙醇）用量（X4）；萃取流量无法控制，设为定值。因试验所用的药材粒度不便进行统计分析，先用单因素方法考察最佳粒度，经含量测定，计算得以60目的提取效果为最佳。此试验有4个因素，6个水平，选用 U6（64）表安排试验，因素水平表见表2，均匀设计参数见表3。每次将250 g虎杖药材粉（60目）投入萃取釜中，按均匀设计表设定的参数进行超临界萃取。

采用 SAS 8.0统计软件，运行后，Shapiro－Wilk统计量为0.888 1，P＝0.308 6＞0.05，模型服从正态分布，但 P（X1，X2，X3，X4）＞0.05，模型无统计量，无法建立逐步回归方程，故建立二次多项式回归方程，程序再次运行后，模型统计量 F＝147.68，P＝0.001 0＜0.01，逐步回归方程有统计学意义。调整决定系数为R2＝0.983 2，回归方程效果较好。X3，X1X2的偏回归系数 t统计量分别为 3.55，16.09，P 值分别为 0.038 2，0.005，应当留在方程中。故建立回归方程为 Y ＝3.022 19 ＋0.024 78X3＋0.0211 7X1X2。

由二次多项式回归方程，X3，X1X2各项均为正号，X1，X2，X3应取试验范围的最大值，X4根据实际情况取最小值，最优点的近似估计值为 X1＝30，X2＝60，X3＝250，X4＝120。故最优方案的近似估计为萃取压力30 MPa，萃取温度60℃，夹带剂用量250 mL（即药粉量的100%），萃取时间120 min。

2.2.2 均匀设计优化条件

根据均匀设计回归方程，采用SAS 8.0软件处理，得到了超临界萃取白藜芦醇的最优化操作条件为，萃取压力30 MPa，萃取温度60℃，萃取时间120 min，夹带剂用量（药粉用量的100%），萃取率0.096 4%。该试验条件下的方程预测值为0.097 7%，与实际值基本相同。

表2 均匀设计因素和水平

表3 均匀设计试验及结果

3 讨论

均匀设计法的特点是将有关试验的水平数均匀分散在实验范围内，使有限的数据具有广泛的代表性，因此可大幅度减少试验次数。本研究采用均匀设计方法，对超临界CO2流体萃取虎杖中白藜芦醇的工艺条件进行优化，所得超临界萃取白藜芦醇的最佳工艺条件为萃取压力30 MPa，萃取温度60℃，夹带剂用量100%，萃取时间120 min。萃取过程中的压力、温度的变化对萃取率的影响起主要作用，因此控制好压力和温度的参数显得尤为重要。超临界二氧化碳萃取白藜芦醇，同传统萃取方式相比较，具有简便、高效、环保、产物易于分离等特点，并且能获得较高的萃取率，是一种很好的白藜芦醇提取分离方法。此外，本研究建立的测定虎杖中白藜芦醇含量的高效液相色谱(HPLC)法具有灵敏、准确、迅速和稳定、经济等特点，可用于虎杖中白藜芦醇的含量测定以及有效成分提取的质量控制。

参考文献:

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