高产蛋白酶活性的枯草芽孢杆菌筛选及鉴定

程德勇，缪礼鸿

(武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023)

蛋白酶是一类广泛应用于食品、纺织、医药、有机合成、洗涤剂及制革脱毛等方面的重要工业和研究用酶，其份额占整个酶制剂市场的一半以上。最大的用途是洗涤剂，其次用于饲料、食品工业、以及制革工业。蛋白酶既可以从动植物组织中提取，也可以通过微生物发酵工艺进行生产。目前生产蛋白酶制剂主要利用曲霉、芽孢杆菌等微生物发酵制备。随着蛋白酶应用的日趋广泛和需求的日益增多，分离筛选能分泌具有良好酶学特性并适用大规模工业生产的蛋白酶高产菌株，是广大科研人员的研究目标和任务［1-2］。

本实验结合透明圈法和福林-酚试剂法［3］从土壤中筛选得到1株产蛋白酶能力强于当前市场上三种枯草芽孢杆菌微生态制剂。通过16S rRNA基因测序及进化树绘制对该菌株进行了分类学鉴定。拟为具有高蛋白酶活性饲料添加剂的研发提供参考菌株。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 土样

1号土样和2号土样均采自武汉轻工大学校园内;3号土样采自武汉市黄陂区。

1.1.2 用于对比的枯草芽孢杆菌菌种:

宜昌某公司畜禽养殖用枯草芽孢杆菌(A菌)和活性净水用枯草芽孢杆菌(B菌);武汉某公司饲用枯草芽孢杆菌(C菌)，以上菌剂均为市购。

1.1.3 培养基

脱脂牛奶固体培养基［4］:牛肉膏 3 g/L;蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，脱脂奶粉 1.5%;琼脂 1.5%—2.0%，水 1 L，pH 7.2—7.4。脱脂奶粉先配 15%100 mL分装5瓶20 mL/100 mL锥形瓶，112℃，灭菌30 min;其他成分配900 mL分装5瓶180 mL/500 mL锥形瓶，121℃，灭菌20 min。倒平板之前，两者混合，摇匀;保藏菌种使用斜面培养基:蛋白胨10 g/L;牛肉膏5 g/L;NaCl 5 g/L;琼脂 1.5%—2.0%;水 1 L;pH 7.2—7.4，使用试管制作斜面;活化培养基:蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 1.5%—2.0%，水 1 L，pH 7.2—7.4;种子培养基:蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 5 g/L，NaCl 5 g/L，水 1 L，pH 7.2—7.4;发酵培养基［5］:蛋白胨 10 g/L;牛肉膏5 g/L;蔗糖10 g/L;磷酸氢二钠4 g/L;硫酸镁 0.2 g/L;水 1 L;pH 7.2。

以上培养基都为121℃，灭菌20 min。

1.2 实验试剂

配制培养基的各种原料、试剂及孔雀绿染料。

测中性蛋白酶酶活所需试剂:福林-酚试剂;0.4 mol/L三氯乙酸(TCA)溶液;0.4 mo1/L碳酸钠溶液;磷酸缓冲液(pH=7.5);0.5 mol/L 的 NaOH;10.00 mg/mL 酪素溶液:称取酪素 1.000 g，准确至0.001 g，用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2—3滴)润湿，加入适量的各适宜的缓冲液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的缓冲液稀释至刻度，此溶液在冰箱内贮存，有效期为3 d;100μg/mL酪氨酸标准溶液:准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.100 0 g，用1 mol/L的盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即1.00 mg/mL的酪氨酸溶液。吸取1.00 mg/mL酪氨酸标准溶液 10.00 mL，用 0.1 mol/L盐酸定容至100 mL，即得 100.0 μg/mL L-酪氨酸标准溶液。

16S rRNA基因测序菌种鉴定所需试剂:Ezup柱式细菌基因组DNA抽取试剂盒(购买于上海生工生物工程有限公司);16S rRNA基因PCR扩增引物:1492r:5’-ggttaccttgttacgactt-3’、27f:5’-agagttgatcctggctcag-3’［6］;Premix Taq 酶(含 DNA Polymerase，dNTP Mixture，PCR Buffer。购于大连宝生物工程有限公司);10×loading Buffer;50×TAE(用时稀释成1×TAE);琼脂糖;EB;D15000 DNA Maker。

1.3 实验方法

1.3.1 产蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选分离

用无菌小铲从三个不同地点取地表下10—15 cm处的土壤，装入纸袋中并做标记。每个土样取1 g倒入含9 mL无菌水的试管中，摇匀后放入80℃恒温水浴锅中处理20 min，然后摇匀稀释，分别取10－4，10－5，10－6三个稀释度涂布到筛选平板中，每个稀释度做3个重复，倒置于30℃恒温培养箱中培养24 h。观察平板上菌落周围的透明圈，并计算出(H/C)比值，标号作好记录。将涂布平板中具有透明圈的菌落在脱脂牛奶平板上进行划线分离纯化。最后将分离出的单菌落接种到斜面培养基中，于30℃恒温培养箱中培养24 h后，放入冰箱中4℃保藏。

1.3.2 L-酪氨酸标准曲线的绘制

L-酪氨酸标准溶液按表1配制。

表1 L-酪氨酸标准溶液制备

分别取上述溶液各1.00 mL(须做平行试验)，各加0.4 mol/L碳酸钠溶液5.00 mL后，再加入福林-酚试剂1.00 mL，摇匀置于40±0.2 ℃水浴锅中显色20 min后，用分光光度计于波长680 nm比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量(μg)，即为吸光常数K值，其K值应在95-100范围内。

1.3.3 中性蛋白酶活性测定

将 A，B，C，和筛选出的 CDY-1，CDY-2，CDY-3，CDY-4，CDY-5，CDY-6 菌株，活化接种子液后，以3%(V/V)的接种量接入发酵培养基(100 mL/250 mL)，37℃、170 r/min培养48 h。按照国标福林-酚试剂法测定出这九株菌发酵液中性蛋白酶活性。比较这九株菌发酵液中性蛋白酶活性大小，选出中性蛋白酶活性强于菌株A，B，C的细菌及透明圈(H/C)值大的菌株CDY-1做芽孢染色实验。

1.3.4 16S rRNA基因测序进行菌种鉴定

按照试剂盒DNA提取操作手册提取CDY-1，CDY-5菌的基因组DNA。

16S rRNA基因PCR扩增:以提取出的细菌基因组 DNA为模板，配置50μL PCR反应体系:Premix Taq 25 μL，模板 2 μL，引物1492r 1 μL，引物27f 1 μL，ddH2O 21 μL。

16S rRNA基因PCR反应条件:94℃，5 min;(94℃，50 s;54℃，50 s;72 ℃，1 min 30 s)30个循环;72 ℃、10 min。

取10μL 16S rRNA基因PCR反应液进行0.8%琼脂糖凝胶电泳30 min后，用EB染色15 min并用凝胶成像系统进行拍照核对DNA扩增片段大小，最后取20μL 16S rRNA基因PCR反应液于1.5 mL EP管中，送至金唯智生物科技(北京)有限公司进行测序。

2 结果与讨论

2.1 产蛋白酶芽孢杆菌筛的选结果

2.1.1 菌落透明圈图片

从三种土壤样品中共分离获得20株水解圈较大的芽孢杆菌菌株，含菌落透明圈的脱脂牛奶固体培养基平板图片如图1所示。

图1 筛选出含透明圈的单菌落平板图

2.1.2 筛选出的20株产蛋白酶芽孢杆菌透明圈(H/C)值

由表2可得，菌株CDY-1透明圈(H/C)值为3.75最大，因此对菌株CDY-1先做芽孢染色观察其形态，再进行16S rRNA基因测序鉴定该菌株，并选择透明圈(H/C)值在3.00以上的六株菌进行液体发酵，测定其发酵液分泌的蛋白酶活性。

表2 20株产蛋白酶芽孢杆菌透明圈(H/C)值

2.2 中性蛋白酶活性测定结果

L-酪氨酸标准曲线测定与绘制结果分别如表3和图2所示。

表3 绘制L-酪氨酸标准曲线的数据表

图2 L-酪氨酸标准?曲线

以吸光度OD值为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制L-酪氨酸标准曲线如图2。其线性回归方程式为:y=0.0102x+0.004，相关系数 R2=0.999 7。当y=1时 ，K=x=97.65。测得的K值在95—100范围内，表明具有一定准确性。

样品中性蛋白酶活性测定结果如表4。

表4 样品中性蛋白酶活性测定结果

由表4得菌株CDY-6在此液体发酵培养基条件下没有分泌蛋白酶，测出的结果为0，表明固体平板上测定的透明圈(H/C)值与液体培养条件下菌株的蛋白酶活性具有一定的相关性，但不一定完全一致，因为固体培养基与液体发酵培养基的营养成分不同。菌株A、B、C在此发酵培养基中分泌的蛋白酶活力分别为 15.31 U/mL，9.84 U/mL，8.44 U/mL。菌株CDY-5的发酵液酶活力为23.44 U/mL，是这九株菌中酶活力最强的一株，故选择菌株CDY-5先做芽孢染色观察其形态，然后进行16S rRNA基因测序来鉴定该菌株。

2.3 芽孢杆菌分类鉴定结果

2.3.1 芽孢染色结果

CDY-1菌芽孢染色结果如图3所示，CDY-5菌芽孢染色结果如图4所示。

图3 CDY-1菌芽孢染色在显微镜10×100倍图

图4 CDY-5菌芽孢染色在显微镜10×100倍图

如图3，4所示，绿色为芽孢，红色为细菌细胞。有的全为红色表明还没有产生芽孢，有的菌体中间为绿色两头为红色表明已经在细胞内产生了芽孢，有的全为绿色表明已经形成了完整的芽孢。由此表明，菌株CDY-1和CDY-5均为芽孢杆菌。比较两图可知，菌株CDY-1菌体大小比菌株CDY-5的大。

2.3.2 16S rRNA基因PCR扩增结果

菌株CDY-1和CDY-5 16S rRNA基因PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示。

图5 16S rRNA基因PCP扩增后琼脂糖凝胶电泳图

由图5可知，两菌株16S rRNA基因 PCR产物大小都在1.5 kb左右，说明此次PCR扩增产物为16S rRNA基因，送测序公司测序。

2.3.3 16S rRNA基因测序和菌种鉴定结果

将菌株CDY-1的16S rRNA基因序列在NCBI官网中使用Nucleotide BLAST比对，选取9株菌种使用MEGA构建菌株CDY-1系统发育树如图6所示。

由图6系统发育树分析可得菌株CDY-1为巨大芽孢杆菌，与菌株CDY-1芽孢染色结果相符合。

图6 CDY-1菌系统发育树

将菌株CDY-5的16S rRNA基因序列在NCBI官网中使用Nucleotide BLAST比对，选取12株菌种使用MEGA软件构建菌株CDY-5的系统发育树如图7。

图7 CDY-5菌系统发育树

由图7系统发育树分析可得出菌株CDY-5为枯草芽孢杆菌，与菌株CDY-5芽孢染色结果相符合。

3 结束语

本实验通过80℃水浴处理土壤样品溶液，再进行稀释，涂布到含脱脂奶粉的牛肉膏蛋白胨培养基中，筛选出20株能分泌胞外蛋白酶的芽孢杆菌。选择透明圈(H/C)值排名前6位及宜昌某公司畜禽枯草芽孢杆菌(标A菌)，活性净水枯草芽孢杆菌(标B菌)，武汉某公司饲用枯草芽孢杆菌(标C菌)进行活化，接种，液体发酵，使用福林酚试剂法测定发酵菌液中性蛋白酶活性。比较结果后，选择蛋白酶活性比A菌(发酵菌液蛋白酶活性15.31 U/mL)，B菌(9.84 U/mL)，C 菌(8.44 U/mL)都强的菌株CDY-5(23.44 U/mL)及透明圈(H/C)值最大的菌株CDY-1(H/C值为3.75)，进行芽孢染色观察及16S rRNA基因测序鉴定菌种。使用MEGA软件构建系统发育树分析得出菌株CDY-1为巨大芽孢杆菌，菌株CDY-5为枯草芽孢杆菌。菌株CDY-1和CDY-5芽孢染色结果与16S rRNA基因测序鉴定菌种结果相符。

本实验的结果表明，所筛选出了一株枯草芽孢杆菌产蛋白酶活性(23.44 U/mL)，比产品化的宜昌某公司畜禽枯草芽孢杆菌产蛋白酶活性(15.31 U/mL)强。国内外文献报道枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力的有许多，Valeria F.Soares等报道枯草芽孢杆菌液体发酵产蛋白酶活力为120 U/mL［7］;张士伟等优化培养基后，枯草芽孢杆菌BS3蛋白酶活力为162.309 U/mL［8］;由此可见，本研究筛选出的枯草芽孢杆菌CDY-5产蛋白酶的活力不是很高。为了尽可能提高此株枯草芽孢杆菌产蛋白酶的活力，还需进一步对此株枯草芽孢杆菌进行诱变育种，并对发酵培养基进行优化。

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