高效液相色谱—荧光法定量测定环境水样中3-MCPD的研究

郭明丽，胡志雄，齐玉堂，张维农

(武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉430023)

食品中的氯丙醇污染已成为国际关注的食品安全问题，其中 3-氯-1，2-丙二醇(3-MCPD)是氯丙醇类食品污染物中最常见的代表物质，主要毒害神经系统和血液循环系统，容易诱发神经病和心脏病，动物实验显示3-MCPD可产生致癌作用，并具有遗传毒性［1］。食品添加剂和污染物联合专家委员会(JECFA)以及欧盟食品科学委员会(SCF)等暂定了人体每日最大耐受量(TDI)为 2 μg/(kgbw·d)［1］。

3-MCPD最早由原捷克斯洛伐克科学家Velisek首先在酸水解植物蛋白(HVP)中发现［2］。其后又陆续在麦芽提取物、变性淀粉、肉类提取物、饼干、面包、香肠、谷物类等中检出，最近又在食用油中也检测到3-MCPD的残留污染。环境水体中，由于工业废水的排放也会导致一定程度的3-MCPD污染，如酸水解植物蛋白生产废水的排放、纸浆生产过程中湿强剂——聚酰胺聚胺表氯醇树脂的使用都是产生3-MCPD污染的重要来源，如不经处理会导致附近水体的污染［3］;另外，在水处理过程中多胺絮凝剂的使用也会产生一定程度的3-MCPD污染［4］。由于3-MCPD对人体危害严重，许多国家都制定了限量标准来控制食品及饮用水中的该项污染物，如英国饮用水检查机构(Drinking Water Inspectorate，DWI)规定饮用水中3-MCPD的最大含量不得超过0.1 mg/L。

由于食品及饮用水中3-MCPD安全限均达到10－9级，故必须采用灵敏度高的检测方法才能达到监控要求，目前常用的手段主要为气相色谱(GC)、气相色谱—质谱联用(GC—MS)。由于3-MCPD的极性与沸点较高，测定过程中均需要将3-MCPD从水样中富集、萃取出来，然后进行衍生化测定。如Matthew等［5］对水样中的3-MCPD进行萃取、吹干、HFBA衍生化处理，然后采用 GC-ECD测定;González 等［6］采用固相萃取(SPE)对水样中 3-MCPD进行富集浓缩，然后使用BSTFA进行衍生化，采用 GC-MS进行分析，检测限可达1.4—11.2 ng/mL。

然而，由于3-MCPD水溶性好，沸点较高，故基于气相色谱测定水样中3-MCPD的分析方法具有以下几方面的缺点:(1)需要采取繁琐、复杂的萃取、浓缩过程，将3-MCPD从水相中提取出来，该前处理过程工作量大，且易产生操作误差;(2)3-MCPD必须进行衍生化处理，且衍生化条件苛刻，需要对样品进行无水化处理，否则误差较大;(3)GC-MS测试仪器昂贵、维护使用成本高，并且对使用者业务能力有较高要求。故发展新型分析方法对检测环境水样中的3-MCPD具有十分重要的意义。

本文建立了一种高效液相色谱—荧光法(HPLC－FLD)对环境水样中的3-MCPD进行测定方法，该方法不需要采取繁琐、复杂的萃取、浓缩过程将3-MCPD从环境水样中提取出来，而是简单对水样进行氧化裂解预处理、荧光衍生化，全部过程均在水相中进行，处理好的样品直接进行高效液相色谱—荧光法测定，因而具有操作简便、测试成本低廉、检测准确度和灵敏度高、仪器设备要求低等诸多优点。

1 实验部分

1.1 主要仪器及试剂

3-MCPD 标准品(97%)、腺嘌呤(99.0%)、氯乙醛二乙缩醛(99.0%)、甘油(99.5%)购自美国 Sigma公司;高碘酸钠、亚硫酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸均为分析纯，购自阿拉丁试剂(上海晶纯实业有限公司);色谱级甲醇购自美国Tedia公司;实验用水为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

HHS电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司)，PHS-3C雷磁pH计(上海精科电子有限公司)，XW-80A微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器有限公司)，Cary Eclipse型荧光分光光度计 (美国瓦里安仪器有限公司)，Waters高效液相色谱仪:Waters1525二元泵，Waters 2475多波长荧光检测器，Waters 2707自动进样器，Breeze-2色谱工作站;色谱柱为 Phenomenex ODS柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)。

1.3 实验方法

1.3.1 3-MCPD 样品的处理

3-MCPD标品的处理:称取10 mg 3-MCPD标准品用二次水溶解定容于100 mL容量瓶中，配成浓度为100μg/mL的母液，取25μL的母液用二次蒸馏水定容于25 mL容量瓶中，稀释成100 ng/mL的标准溶液备用。

样品预处理:在具塞试管中加入2 mL 3-MCPD(100 ng/mL)的标准溶液，然后加入0.1 mL NaIO4溶液(250 mM)，用漩涡混合仪混合均匀，在室温暗处反应30 min，反应完后加入0.1 mL Na2SO3溶液(275 mM)，混匀后在室温下反应20 min。

样品荧光衍生化:根据Huang等报道［7］的氯乙醛衍生化过程略作修改，在上述样品溶液中加入0.2 mL的腺嘌呤(16 mg/mL)溶液(用0.1 M PBS溶液配制，pH 4.5)，旋涡混合均匀，在90℃水浴条件下反应3 h，反应结束后冷却至室温。在进高效液相色谱检测前样品储存在4℃条件下。作为对照，氯乙醛按相同方法进行处理。

1.3.2 样品的高效液相色谱(HPLC)检测

色谱条件:流动相为甲醇—水(20∶80，V/V)，检测的激发波长(λEx)为308 nm，发射波长(λEm)为405 nm，流动相流速为 0.6 mL/min，进样体积为20μL。上述样品在HPLC检测前用0.22μm有机相滤膜过滤。

1.3.3 样品的荧光检测

美国Varian公司配有闪烁氙灯和10 mm石英比色皿的Cary Eclipse型荧光分光光度计，激发波长和发射波长狭缝均设定为5 nm，数据扫描速率为600 nm·min-1，用荧光分光光度计进行相关光谱条件优化。衍生化后样品经HPLC分离后采用荧光检测器进行定性测定。

1.3.4 精密度实验和加标回收率实验

(1)精密度实验:配制 0.04 μg/mL，0.1 μg/mL，0.2μg/mL的三种不同浓度的3-MCPD标准溶液，每种分别采用在同一天测定5次和连续5 d测定的方式进行检测，根据测得的εAde的峰面积得出实际浓度，然后来评价实验的精密度。

(2)加标回收率实验:用超纯水配制0.25μg/mL，1.12μg/mL的两种不同浓度的3-MCPD样品，每种取2mL，分别加入50mL，100mL，200mL的10 μg/mL的3-MCPD标准溶液，按照优化后的方法进行检测，得到εAde的实际峰面积，然后根据标准曲线计算的理论值得出回收率。

1.3.5 样品的检测

收集自来水(2012-07-12，武汉轻工大学1号实验楼820实验室)、长江水(2012-06-20，武汉二桥桥底)、武汉东湖水(2012-06-20，武汉大学凌波门对面)、武汉纸厂附近(2012-06-20，武汉造纸厂外小河流下游)水域的水样，经离心、滤膜处理后按以上HPLC-FLD方法进行检测，根据目标峰的峰面积和标准曲线计算其3-MCPD的含量。

2 结果与分析

2.1 HPLC-FLD法测定3-MCPD的原理

众所周知，邻二醇结构化合物可以被高碘酸盐氧化裂解，生成相应的醛类化合物，该反应自1928年Malaprade首次发现以来［8］，已经被广泛应用于环境、地质和生物等多种样品的检测，最近Vlessidis［9］将其应用于多糖和低聚糖的结构检测和表征中。3-MCPD是一种典型邻二醇结构化合物，经高碘酸钠氧化分解后生成小分子的氯乙醛和甲醛，其中氯乙醛为其特征降解产物，腺嘌呤(Ade)可以与其选择性衍生化，生成强荧光性物质εAde，通过测定目标峰εAde可以对样品中3-MCPD的含量进行定量测定;图1显示了该方法测定3-MCPD的机理。

2.2 Ade和衍生化产物εAde的荧光光谱分析

图1 氧化、荧光衍生化测定3-MCPD的原理

为了使建立的HPLC-FLD方法获得高灵敏度和低检测限，确定最佳荧光测定波长，本实验对衍生化产物εAde的荧光激发光谱与发射光谱进行了比较测定，图2为两者的荧光光谱比较结果。从图2可以看出，εAde的激发波长和发射波长分别为311 nm和405 nm，与Ade(激发波长和发射波长分别为291 nm和380 nm)相比，其最大激发波长和发射波长分别红移了15 nm和25 nm，为了获得较好的检测灵敏度与选择性，检测时均将εAde的激发波长和发射波长设为测定波长，即λEx=311 nm，λEm=405 nm。

图2 Ade和衍生化产物εAde的激发光谱(虚线)与荧光发射光谱(实线)比较

2.3 处理后样品的HPLC色谱分析

腺嘌呤及衍生化产物 εAde的疏水保留均较弱，为了尽量延长保留时间以减少干扰物质对其分析准确度的影响，本实验采用了较长的色谱柱(25 cm)与有机相含量较低的流动相对其进行色谱测定，实验中还对空白PBS缓冲液、衍生化试剂Ade和3-MCPD、氯乙醛的色谱分析结果进行对比，以确定最终荧光衍生化产物的色谱峰位置，比较结果如图3所示。谱图显示:3-MCPD和氯乙醛样品中均出现产物εAde的色谱峰，并且与衍生化试剂Ade的色谱峰能够很好地分离，其保留时间分别为13.1 min和6.9 min，良好的分离效果与对称峰形确保该方法具有良好的准确度;荧光检测器的使用也使得该方法具有良好的选择性与优异的检测灵敏度。

2.4 3-MCPD的定量分析结果评价

为了考察该方法的线性，本实验在优化条件下，调节3-MCPD的浓度从1—1 000 ng/mL，以峰面积作为考察对象，绘制标准曲线，得到相应回归方程为Y=(1.908X+2.702)×104，线性相关系数 R2=0.9996。该方法灵敏度非常高，根据基线噪音峰的三倍来计算该方法的最低检测限为0.36ng/mL，这与Carro报道［10］的 GC-MS/MS方法相近，比 Matthew报道［5］的GC-ECD方法更低。另外通过对10 μg/mL3-MCPD标准品和9.0μg/mL的氯乙醛标准溶液的峰面积比较，得出3-MCPD转化为氯乙醛的得率为98.96%，这说明高碘酸氧化对该方法的影响是可以忽略的。

图3 衍生化产物及对照样品色谱分析图

为了考察方法的精密度，实验以三种不同浓度的3-MCPD样品作为模拟样品，对每种样品进行同一天测量5次和连续测量5d两种不同的重复性实验，实验结果如表1所示:同一天重复测量的重现性范围为97.04%—101.89%，精密度范围为2.2%—4.8%;连续5d测量的重现性范围为97.48%—100.28%，精密度范围为 3.6%—5.1%，这说明该方法具有良好的重现性和精密度。

表1 精密度实验结果

模拟两种不同浓度的样品，加入不同量的标品，通过实际得到的峰面积与理论值比较，得到该方法的回收率，实验结果见表2。从表2中可以看出所有样品的回收率在93%以上，平均回收率在95.72%，相对标准偏差在2.63%—3.49%之间，说明该方法的精确度很高。

表2 加标回收率实验结果

2.5 实际环境水样的分析

为了考察本方法对实际环境水样的分析效果，采集了自来水、江水、湖水、造纸厂附近水域(零下18℃冷冻保存)的水样600mL，按实验方法的步骤进行处理、分析，测试的结果如图4所示。从图4中可以看出，虽然实际水样成分比较复杂，但使用该方法测定时，谱图中干扰峰较少，对测定基本上没产生影响，说明该方法的选择性很好，非常适合环境水样中3-MCPD的测定。从水体中测得3-MCPD平行三次结果如表3所示，可以看出检测结果的精密度范围在1.19%—5.83%，可知通过该方法检测的3-MCPD重现性非常好。比较四种水样目标峰的大小可知，自来水样中3-MCPD最低，而纸厂附近水域的3-MCPD含量较高，根据相应的εAde峰面积进行计算，自来水、江水、湖水、纸厂水样中3-MCPD含量分别为2.3 μg/L，6.5 μg/L，9.2μg/L，11.2 μg/L，均明显低于DWI饮用水的标准。

表3 不同水体中3-MCPD的含量

图4 几种不同环境水样色谱分析图

3 结论

笔者建立了一种HPLD对环境水样中的3-MCPD进行测定方法，该方法不仅操作简便、测试成本低廉，而且灵敏度高、准确度好，对仪器设备要求也较低，优化条件下的标准曲线线性良好，其最低检测限为0.36 ng/mL，达到甚至优于文献报道的GCMS/MS的检测方法;日内与日间重现性评价结果表明该方法具有良好的稳定性、准确度和精密度。对四种不同来源的实际环境水样测试结果表明，该方法选择性好，谱图中干扰峰少，目标峰形对称，非常适合环境水样的测定。

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