三七总皂苷对血脂异常患者内皮祖细胞数量的影响

邝颖颐，黄经光，彭荣珍，卢俊娴，陈文静，苏雪芳

(1.暨南大学医学院第六附属医院，广东 江门 529000；2.江门中医药学校，广东 江门 529000)



三七总皂苷对血脂异常患者内皮祖细胞数量的影响

邝颖颐1*，黄经光1，彭荣珍2，卢俊娴1，陈文静1，苏雪芳1

(1.暨南大学医学院第六附属医院，广东 江门 529000；2.江门中医药学校，广东 江门 529000)

目的：观察三七总皂苷对血脂异常患者内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)数量的影响。方法：将64例血脂异常患者随机分为治疗组与对照组各32例，对照组采取常规治疗，治疗组在对照组基础上加用血栓通注射液治疗，疗程为10天。疗程结束后抽取患者外周全血20mL进行EPCs培养，运用贴壁选择法，采用流式细胞术观察三七总皂苷对EPCs数量的影响。 结果：三七总皂苷能提高血脂异常患者外周全血EPCs数量，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论：三七总皂苷可显著改善血脂异常患者EPCs的数量，并通过该途径保护心脑血管。

血栓通注射液；血脂异常；内皮祖细胞

血脂异常是导致冠心病、脑血管意外、动脉粥样硬化等重要危险因素。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是指特异性归巢于血管新生、血管损伤部位，机体中存在可分化成内皮细胞的干/祖细胞，该细胞具有防治血管成形术后再狭窄、预防早期动脉粥样硬化、修复体内血管内膜的损伤等作用。相关研究[1]报道，血脂异常患者外周血中内皮祖细胞出现功能受损，且数量减少。因此，研究有效药物增加外周血功能EPCs数量，成为防治冠心病、脑血管意外、动脉粥样硬化等疾病的重要方法。血栓通注射液是由中药三七经提取精制的中成药注射液，主要成分为三七总皂苷。据研究[2]表明，三七总皂苷具有改善脑循环、防治心肌缺血再灌注损伤、抗血栓、抗动脉粥样硬化及降脂肪等作用，但目前研究仅局限于动物整体水平和离体器官等研究，尚未深入到分子、细胞水平，缺乏循证医学支持。观察血栓通注射液对血脂异常患者内皮祖细胞功能和数量的影响，从细胞水平进一步明确血栓通注射液的作用机制。

1 资料与方法

1.1 纳入标准

血脂异常患者诊断标准参照2007年中国成人血脂异常防治指南制定联合委员会制定的《中国成人血脂异常防治指南》。[3]

1.2 排除标准

不符合纳入标准者；伴有严重并发症；合并患有严重循环系统、呼吸系统、消化系统等疾病；合并有恶性肿瘤、感染、外科手术、视网膜病变、外伤等影响内皮祖细胞疾病；药物过敏及过敏体质者；依从性差，不配合治疗者。

1.3 一般资料

选取2012年1月—2014年1月我院收治的64例血脂异常患者作为研究对象，按住院时间随机分为治疗组与对照组各32例。其中治疗组男18例，女14例，年龄41～71岁，平均年龄(55±9)岁，病程11个月至3年；对照组男15例，女17例，年龄42～69岁，平均年龄(53±7)岁，病程1～4年。两组患者的性别、年龄、病程等资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.4 方法

1.4.1 药物与材料 血栓通注射液(0.25g，广西梧州制药(集团)股份有限公司，批号13110714)，DiI-ac-LDL(Molecular probe公司)，PBS、Hanks液、ECSG、M199、胰酶、胎牛血清(均购自GIBCO公司)，FITC-AC133及PE-VEGFR-2(Bender systemTM)，PE-CD34(Caltag Laboratories)，MTT(华美生物工程公司)，VIII因子免疫组化相关抗原试剂盒(武汉博士德生物工程公司)，VEGF(Peprotech EC公司)，纤维连接蛋白(Roche公司)。

1.4.2 治疗方法 对照组予以常规治疗，治疗组在对照组基础上给予血栓通注射液450mg，溶于5%葡萄糖注射液或0.9%生理盐水静脉滴注，1次/d，疗程为10天。疗程结束分别抽取两组患者空腹全血20mL，对血中EPCs进行培养并分析。

1.4.3 EPCs培养 纤维连接蛋白预先包被24孔培养皿，取全血20mL分离单个核细胞。方法：采用密度梯度离心法，以5×106个/mL种于培养皿，将1mL含链霉素(100U/mL)、青霉素(100U/mL)及胎牛血清(20%)的M199加入每个培养皿，置培养箱中培养，培养环境为饱和湿度、5%CO2和37℃。3天后添加培养液，洗去未贴壁细胞，继续培养待用[4]。

1.4.4 EPCs鉴定 吸取0.25%的胰酶适量消化培养后的EPCs，并制成单个细胞悬液(1×106个/mL)，加入10μL(1mg/mL)荧光标记的AC133、VEGFR-2、VE-Cadherin或CD34，采用流式细胞仪分析细胞中AC133、VEGFR-2、VE-Cadherin、CD34的表达水平。以2.4μg/mL终浓度加入培养皿DiI-ac-LDL避光与细胞孵育4h，荧光显微镜下观察洗去培养液后的细胞荧光指标；以同批培养细胞作为空白对照组，但不加DiI-ac-LDL，验证培养细胞吞噬DiI-ac-LDL能力，采用GSC7901(胃癌细胞株)予阴性对照。检测免疫组化法培养细胞Ⅷ因子相关抗原的，采用GSC7901予阴性对照[5]。

1.4.5 EPCs数量检测

取各组1/10分离的单个核细胞，制成单个细胞悬液(1×106个/mL)，加入荧光标记的AC133、CD34各10μL(1mg/mL)，通过流式细胞仪分析细胞AC133、CD34的表达，运用Quest软件分析计算双阳性细胞。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 EPCs鉴定

洗去碎片及未贴壁细胞，培养3天后，可见典型细胞集落：向外扩散，外周为纺锤形细胞，层层叠叠；中间为大量圆形细胞，略高于培养平面，呈白色半透明，见图1。流式细胞仪分析显示6天后细胞AC133、VEGFR-2、VE-Cadherin和CD34表达。荧光显微镜检：多数细胞随培养时间延长可吞噬DiI-ac-LDL，激发灰色荧光，见图2；阴性对照和空白对照均无荧光。免疫组化示培养2天后Ⅷ因子相关抗原为阳性，呈棕色胞浆，阴性对照和空白对照均不显棕色。

图1 细胞集落(×100)

图2 细胞吞噬DiI-ac-LDL(×200)

2.2 血栓通注射液对全血EPCs数量的影响

与对照组相比，血栓通注射液能够增加EPCs数量，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 血栓通注射液对全血EPCs数量的影响 个/mL)

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

血脂异常患者血清中ox-LDL过高可诱导内皮细胞的氧化损伤甚至凋亡，从而导致内皮功能障碍。因此血脂异常为冠心病、脑血管意外、动脉粥样硬化等心脑血管疾病的重要致病因素。相关研究报道[6]，损伤内皮的再内皮化可有效减少新内膜厚度和平滑肌细胞增殖，而再内皮化过程需EPCs的参与。

EPCs作为内皮细胞的同一谱系，其功能和数量同样受到血脂异常的影响，主要作用机制为：ox-LDL影响EPCs的动员及分化；ox-LDL参与EPCs的凋亡过程；ox-LDL直接损伤EPCs。提示通过治疗手段提高血脂异常患者外周血中EPCs数量，能有效降低血脂异常患者发生冠心病、脑血管意外、动脉粥样硬化等并发症概率。

血栓通注射液为传统中药材三七经提取工艺精制而成的中成药注射液，主要成分为三七总皂苷。现代药理研究表明血栓通注射液作用机制可能通过减少骨髓基质细胞RANKL表达，增加OPG表达[7]。实验研究证明，三七总皂苷可显著提高血脂异常患者外周血中EPCs数量，从细胞水平上为三七总皂苷作用心脑血管途径提供了新的理论依据，具有极大意义。

[1] 季亢挺，张怀勤，李海鹰，等.高胆固醇血症患者外周血内皮细胞的变化及丹参的保护作用[J].中华中医药学刊,2007,25(6):1173-1175.

[2] 陈剑梅，郭洁文.三七总皂苷对心脑血管作用的药理研究新进展[J].今日药学,2011,21(7):389-392.

[3] 中国成人血脂异常防治指南制订联合委员会.中国成人血脂异常防治指南[J].中华心血管病杂志,2007,35(5):390-419.

[4] 季亢挺，张怀勤，唐积肥，等，丹参对高胆固醇血症患者内皮祖细胞数量及功能的影响[J].中国中药杂志,2007,32(12):1214-1217.

[5] WERNER N, JUNK S, LAUFS U, et al. Intravenous transfusion of endothelial progenitor cells reduces neointima formation after vascular injury[J]. Circulation Res,2003,93(2):e17.

[6] GRIESE D P, EHSAN A, MELO L G, et al.Isolation and transplan-tation of autologous crculating endothelial cells into denuded vessels and prosthetic grafts：implications for cell-based vascular therapy[J]. Circulation,2003,108(21):2710.

[7] 王云国，刘东昕，王虎，等.三七总皂甙对大鼠骨髓基质细胞OPG/RANKL表达比的影响[J].今日药学,2012,22(8):456-459.

(责任编辑：李岚春)

2014-05-08

邝颖颐，女，广东省江门市暨南大学医学院第六附属医院主管药师，研究方向为临床药学。

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1673-2197(2014)16-0090-02