活性炭纤维固定化菌对微囊藻毒素MC-LR的去除研究

袁 媛,吴 涓,李玉成,王 宁 (安徽大学资源与环境工程学院, 安徽 合肥 230601)

活性炭纤维固定化菌对微囊藻毒素MC-LR的去除研究

袁 媛,吴 涓,李玉成*,王 宁 (安徽大学资源与环境工程学院, 安徽 合肥 230601)

研究了藻蓝蛋白提取过程中微囊藻毒素MC-LR的释放分布规律,并用活性炭纤维对一株微囊藻毒素降解菌株进行了固定化,考察了不同活性炭纤维预处理方法、活性炭纤维用量、pH值、温度以及MC-LR浓度对固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影响.结果表明,藻蓝蛋白提取过程中MC-LR主要分布在超滤滤液中,占MC-LR总含量的81.2%.固定化藻毒素降解菌去除 MC-LR的效率明显高于非固定化藻毒素降解菌. 藻毒素降解菌用(1+9)盐酸预处理后的活性炭纤维固定化,其去除效果最佳.MC-LR去除的最适条件为:活性炭纤维用量为10g/L,温度为35℃, pH值为8.0.固定化藻毒素降解菌对pH值,温度具有一定的耐受性,能够在pH5～pH9、10℃～35℃范围内有效地去除MC-LR.

微囊藻毒素-LR；固定化；活性炭纤维；去除率

近年来,巢湖每年都暴发以铜绿微囊藻为主的“水华”,有时堆积可达数km长,数cm厚,腐败分解后,发出恶臭,严重破坏水体及周围环境[1].为消除巢湖蓝藻污染,将打捞上来的蓝藻的资源化利用已成为目前的研究热点[2-3].

蓝藻中含有丰富的藻蓝蛋白,藻蓝蛋白是一种宝石蓝色的天然色素,被广泛应用于食品、饮料、医药、化妆品行业,但是目前国内外主要从淡水养殖的螺旋藻中提取藻蓝蛋白,其成本昂贵,从而限制了藻蓝蛋白的应用发展[4].目前国内已有从水华蓝藻中提取藻蓝蛋白的报道,但是尚未进行大规模推广.同时,由于巢湖爆发的水华蓝藻以铜绿微囊藻为主[5],而铜绿微囊藻细胞内含有微囊藻毒素, 其性质稳定,是一种致肝癌毒素,对人体具有极大的危害[6].从蓝藻中提取藻蓝蛋白必须破壁,蓝藻一旦破裂微囊藻毒素就释放出来,污染藻蓝蛋白,残渣残液中也含有大量的微囊藻毒素,其任意排放将严重污染水体.因此在利用蓝藻提取藻蓝蛋白的过程中必须将微囊藻毒素去除.

目前微囊藻毒素的去除方法主要有物理方法和化学方法等,而微生物降解技术除了具有降解彻底的特点以外,还具有处理成本低,且更安全有效[7]等优势.虽然能够降解微囊藻毒素的微生物已有报道[8],但其研究重点主要集中于高效降解菌的筛选及其特性研究[9],而采用活性炭纤维固定化菌来去除藻毒素的研究尚不多见.

固定化微生物技术因其微生物密度高、处理效率高、稳定性强、耐冲击负荷等优点,目前在环境领域应用广泛,将其应用于微囊藻毒素污染水体的治理有着很大的发展潜力和应用前景[10].活性炭纤维具有发达的微孔结构、优异的吸附性能、较高的机械强度和良好的生物相容性,易于微生物的固着[11].因此本文以活性炭纤维为固定化材料,研究固定化藻毒素降解菌对微囊藻毒素MC-LR的去除效果,探讨pH值、温度、MC-LR初始浓度等因素对其去除效率的影响,以期为藻毒素降解菌的应用探索新的途径.

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种:所用菌种为实验室从巢湖沉积物中分离出的一株藻毒素降解菌,经鉴定为蜡状芽孢杆菌[12].

活性炭纤维:黏胶基毡状,比表面积为 1600～1800m2/g.

藻 毒 素 标 准 品 MC-LR(分 子 式 : C49H74N10O12,分子量: 995.2)购自美国 Sigma公司,纯度≥95% .

试剂:甲醇、三氟乙酸为色谱纯试剂,购自上海星可生化有限公司;氯化钠、硫酸镁等为分析纯试剂,购自上海中试化工总公司;胰蛋白胨、酵母浸粉等购自北京奥博星生物技术有限公司.

主要仪器:SW-CJ-2D超净工作台(苏州净化设备有限公司);ZHP-160智能恒温摇床培养箱(上海三发科学仪器有限公司); PHO50A 恒温培养箱(上海一恒科技有限公司);CT14RD型高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备有限公司);Waters Alliannce-2695型高效液相色谱仪,配Waters SunFire C18(4.6×250mm)色谱柱.

营养培养基:采用LB培养基,胰蛋白胨10.0g,酵母浸粉5.0g, NaCl 10.0g ,H2O 1000mL.

无机盐培养基:采用基础培养基[13],添加提取纯化的MCs作为微生物生长的唯一碳源和氮源,其初始pH值为7.5.

1.2 实验方法

1.2.1 MC-LR的提取纯化及检测 实验所用藻毒素为蓝藻提取藻蓝蛋白过程中所释放的藻毒素,提取纯化方法在参考文献[14]的基础上略微做了调整,即采用 5%的乙酸溶液取代文献中的甲醇作为 MCs 的提取剂.

藻蓝蓝白的提取纯化方法及技术路线如下:采集新鲜藻浆,冻融破壁得上清液,上清液加入20%饱和度的硫酸铵盐析,离心得上清液,上清液加入50%饱和度的硫酸铵盐析,离心得沉淀,将沉淀复溶于去离子水中,复溶的粗提液通过双水相萃取得到富含藻蓝蛋白的上相,采用超滤除杂的方法提取藻蓝蛋白[15].在藻蓝蛋白提取过程中,提取检测各阶段废弃物中以及藻蓝蛋白浓缩液中MC-LR的含量.

MC-LR的检测条件:Waters Alliannce-2695型高效液相色谱仪,DAD二极管阵列检测器为Waters-2996型,流动相是60%甲醇+40%水,水相中含有 0.05%的三氟乙酸,流速为 1.0mL/min,检测波长为 238nm,进样量为 20μL.每个样品平行测定3次.

1.2.2 活性炭纤维的预处理 将活性炭纤维用去离子水冲洗至无浮渣后放入烧杯中,加入去离子水煮沸 1.0～1.5h,然后分别在去离子水, (1+9)盐酸, 10%NaOH溶液中浸泡24h,并用去离子水冲洗至中性并沥干.将其平摊在搪瓷托盘中,用牛皮纸封盖后放入烘箱,于 140℃中烘 48h,取出并置于干燥密闭容器内待用.

1.2.3 藻毒素降解菌的固定化 将预处理后的活性炭纤维加入装有 50mL营养培养基的锥形瓶中,于120℃下灭菌20min.接种藻毒素降解菌,于30℃、140r/min下振荡培养,让菌体充分固定于活性炭纤维中.固定化完成后,将活性炭纤维用生理盐水洗涤2次.

1.2.4 扫描电子显微镜观察固定化效果 采用日本日立S-4800扫描式电子显微镜观察固定化前后活性炭纤维表面的微生物生长情况.

1.2.5 藻毒素降解菌的生长曲线测定 在无机盐培养基中接种藻毒素降解菌,于30℃、140r/min下振荡培养,置于黑暗处防止光降解.定时取出发酵液,用分光光度计测其在 600nm处的吸光度(OD600).以培养时间为横坐标、OD600为纵坐标绘制藻毒素降解菌的生长曲线.

1.2.6 MC-LR的分析测定 首先用MC-LR标准品配制浓度分别为 1.0,2.0,4.0, 6.0, 8.0, 10.0mg/L的标准溶液,然后根据高效液相色谱(HPLC)图上 238nm 波长处的峰面积,建立峰面积与标准溶液浓度之间的一元线性回归方程.在去除 MC-LR过程中,取样离心,将上清液过0.45um滤膜,收集滤液,在 HPLC上测定其峰面积,代入回归方程即可计算MC-LR的浓度.

为减少操作过程中产程的系统误差,提高分析精确度,MC-LR的检测采用内标法.标准曲线的相关系数＞0.999.本研究得到的加标回收率为91.5%～105.6%,相对标准偏差为 2.38%～4.31%,最小检测限小于 1μg/L,表明本试验具有较高的准确度.

1.2.7 固定化藻毒素降解菌去除 MC-LR的影响因素研究 在 150mL三角瓶中加入 50mL无机盐培养基并灭菌,将固定化的藻毒素降解菌接种至上述培养基中,在 30℃、140r/min 条件下培养,置于黑暗处防止光降解.每隔 24h 取样测定培养液中 MC-LR 的浓度.MC-LR的去除率可用式(1)求得.

D(%) = (A0-A)/ A0×100% (1)式(1)中: A0为空白培养液中 MC-LR 的初始浓度; A为接种固定化藻毒素降解菌并培养一定时间后的培养液中 MC-LR 的浓度;D为MC-LR的去除率,%.

分别考察不同活性炭纤维用量、不同 pH值、不同 MC-LR初始浓度及不同温度条件下固定化藻毒素降解菌对MC-LR去除率的影响.在相同条件下,以加入非固定化藻毒素降解菌作为对照.为简化表述,下文将固定化藻毒素降解菌称为固定化菌,将非固定化的藻毒素降解菌称为游离菌.

采用 PASW Statistics 18.0 统计软件对实验结果进行方差分析.

2 结果与讨论

2.1 藻蓝蛋白提取过程中藻毒素含量的测定

在藻蓝蛋白提取过程中,提取检测各阶段废弃物中以及藻蓝蛋白浓缩液中藻毒素的含量,其中藻蓝蛋白浓缩液中未检测到 MC-LR,各阶段废弃物中MC-LR含量分布情况如图1所示.由图1可见,MC-LR主要分布于超滤滤液中,其含量达到总含量的81.23%.在硫酸铵盐析及双水相萃取阶段,MC-LR并不能有效的从藻蓝蛋白中分离出来,这对藻蓝蛋白的提取纯化及 MC-LR的去除具有一定的指导意义,即可以在藻毒素集中的提取阶段进行重点治理,其他阶段可采取一般的水处理工艺.

图1 MC-LR在藻蓝蛋白提取过程中的分布Fig.1 Distribution of MC-LR in the phycocyanin extraction

2.2 藻毒素降解菌的生长曲线

图2 藻毒素降解菌的生长曲线Fig.2 Growth curve of microcystin-degrading strain

由图 2可见,藻毒素降解菌在营养培养基中的生长延滞期为10h左右, 在此期间菌体为适应新环境而表现出生长迟缓;培养10h后,菌体进入对数生长期,在此期间菌体数量呈指数倍增,48h时已达到生长高峰,72h后进入生长稳定期.因此,将藻毒素降解菌的培养时间和固定化培养时间均选为48h.

2.3 活性炭纤维预处理

图3表明,采用(1+9)盐酸预处理的活性炭纤维,其固定化菌对 MC-LR的去除率最高,达到89.2%,比不经任何预处理的活性炭纤维固定化菌高出 36.0%.实验同时也证明了活性炭纤维在使用前进行预处理的必要性.由于活性炭纤维表面是微孔结构,极易吸附空气中的杂质,从而影响微生物的固定[15],所以在使用前需要进行预处理,经过严格的处理后,活性炭纤维上的杂质将会明显降低,为下一步的实验创造有利条件[16].因此,研究过程中选用(1+9)盐酸预处理的活性炭纤维作为实验材料.

图3 活性炭纤维预处理方法对固定化藻毒素去除菌去除MC-LR的影响Fig.3 Effects of the activated carbon fiber pretreatment methods on the removal of MC-LR by immobilized microcystin-degrading strain纵条表示标准偏差(N = 3),下同

2.4 扫描电子显微镜观察固定化效果

由图4可知,活性炭纤维呈束状纤维,固定化前,其表面光滑,固定化后,微生物主要附着在活性炭纤维束的表面,有利于其生长繁殖,既可以充分发挥活性炭纤维的吸附性能,又可以充分发挥微生物的生物降解能力[17].活性炭纤维具有良好的生物相容性,它作为微生物的载体是可行的.

图4 活性炭纤维表面的电镜照片Fig.4 SEM images of the surface of activated carbon fibera.固定化前的活性炭纤维, b.固定化后的活性炭纤维

2.5 固定化藻毒素降解菌去除 MC-LR 的影响因素研究

2.5.1 活性炭纤维用量的影响 在藻毒素降解菌的固定化培养过程中,使营养培养基中活性炭纤维的浓度分别为2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0g/L.培养 48h后将固定化菌体接种于无机盐培养基中,培养基中MC-LR的初始浓度为6.8mg/L, pH值为8时,温度为35℃,5d后取样测定藻毒素去除率,结果如图5所示.

由图 5可知,活性炭纤维用量并不是越多越好,当用量为2.0～10.0g/L时, MC-LR的去除率随着活性炭纤维用量的增加而上升(77.3%～92.9%);当用量多于10.0g/L后, MC-LR的去除率开始呈下降趋势.藻毒素降解菌的固定化过程主要是使菌体细胞附着于活性炭纤维上,所附着的菌体量与活性炭纤维的用量成正比.虽然菌体细胞数量的增长在一定程度上会提高藻毒素去除率,但是菌体细胞的过量生长会导致营养物质短缺,且菌体细胞密度过大不利于微生物的生长,会导致细胞的新陈代谢与生长速度减缓,从而影响藻毒素的去除.由此可确定藻毒素降解菌固定化时的最佳活性炭纤维用量为10g/L.

图5 活性炭纤维用量对固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影响Fig.5 Effects of dosage of activated carbon fiber on the removal of MC-LR by immobilized microcystin-degrading strain

2.5.2 pH值的影响 控制活性炭纤维用量为10g/L,无机盐培养基中 MC-LR的初始浓度为6.8mg/L,分别将培养基的 pH 值调节为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,接种固定化菌,考察环境 pH 值对固定化藻毒素降解菌去除 MC-LR的影响,结果如图 6所示.反应 5d后固定化菌和游离菌去除MC-LR的效率对比见图7.

图6 pH值对固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影响Fig.6 Effects of pH on the removal of MC-LR by immobilized microcystin-degrading strain

由图6可知,在反应初期,MC-LR的去除率并不高,但随着反应时间的延长,不同 pH值条件下去除率显著增加(P<0.05).在反应前3d内平均去除效率达到 77.2%,随后去除率的增加趋于缓慢.图7表明,当pH值为5.0～9.0时,固定化菌和游离菌对MC-LR的去除率分别为87.2%～90.9%和10.6%～59.6%,可见固定化菌的藻毒素去除率明显高于游离菌.在pH5.0～9.0范围内,固定化菌对MC-LR的去除率保持在较高水平,并在pH8.0时达到最大,为90.9%.而游离菌对MC-LR的去除率在 pH5.0～8.0范围内则呈现明显的增加趋势,且在pH8.0时去除率也达到最大,为59.6%.pH值继续增大,MC-LR的去除率又开始下降.微生物生长环境的 pH值对其生长产生很大的影响,一方面是由于pH值会使细胞膜上的电荷发生变化,从而使细胞膜的通透性发生改变,部分离子渗透作用加强或减弱,从而扰乱了细胞对物质交换过程的控制;另一方面是由于培养基中某些有机物质的离子化状态和营养元素会因环境pH值的变化而改变其存在状态,从而使细胞吸收和代谢营养物质的途径出现障碍,而最重要的是细菌分泌的胞内或胞外酶活性都对环境pH值有很大的敏感性[18].本实验表明,固定化藻毒素降解菌对环境pH值的变化有更好的耐受性,可以承受pH值的较大变化而保持较高的MC-LR去除率.

图7 不同pH值条件下固定化菌与游离菌对MC-LR的去除Fig.7 The removal of MC-LR by immobilized strain and free strain under different pH values

2.5.3 温度的影响 在活性炭纤维用量为10g/L,无机盐培养基中 MC-LR的初始浓度为6.8mg/L, pH值为 8时,设置温度分别为 10,15, 20,25,30,35℃,接种固定化菌,考察温度对固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影响,结果见图8.反应5d后固定化菌和游离菌去除MC-LR的效率对比见图9.

图8 温度对固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影响Fig.8 Effects of temperature on the removal of MC-LR by immobilized microcystin-degrading strain

图9 不同温度条件下固定化菌与游离菌对MC-LR的去除Fig.9 The removal of MC-LR by immobilized strain and free strain under different temperature

由图 8可知,随着反应时间的延长,MC-LR的去除率在前3d显著增加(P<0.01),平均去除率可达到72.9%,但随后MC-LR去除率的增加趋于平缓.温度对该菌的去除效果具有显著的影响(P<0.05),随温度的升高,去除率略有上升.从图 9可知,游离菌在 10℃～35℃的范围内,对 MC-LR的去除率为10.2%～60.6%,波动较大;而固定化藻毒素降解菌在相同条件下对 MC-LR的去除率则为 79.1%～92.7%,普遍较高.这一结果表明,固定化藻毒素降解菌受温度的影响较小,尤其是在低温条件下,固定化菌的藻毒素去除活性依然较高.当温度为 35℃时,固定化菌和游离菌对 MC-LR的去除率均达到最高值,分别为 92.7%和 60.6%,固定化菌的藻毒素去除率明显高于游离菌.因此,固定化藻毒素降解菌对温度具有更好的耐受性. 2.5.4 MC-LR初始浓度的影响 在活性炭纤维用量为10g/L,温度为35℃,pH值为8时,考察不同MC-LR初始浓度对固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影响,结果见图10.反应5d后固定化菌和游离菌去除MC-LR的效率对比,结果见图11.

图10 MC-LR初始浓度对固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影响Fig.10 Effects of initial MC-LR concentrations on the removal of MC-LR by immobilized microcystindegrading strain

图11 不同MC-LR初始浓度下固定化菌与游离菌对MC-LR的去除Fig.11 The removal of MC-LR by immobilized strain and free strain under different initial MC-LR concentrations

由图10可知,随着反应时间的延长,MC-LR的去除率在前3d显著增加(P<0.01),平均去除率达到 77.9%,随后去除率的增加变得不显著.由图11可见,当MC-LR初始浓度为1.7～13.6mg/L时,固定化菌和游离菌的藻毒素去除率分别为78.8%～92.6%和 22.4%～55.4%,且固定化菌和游离菌的藻毒素去除率均随着藻毒素初始浓度的增大而呈上升趋势;当 MC-LR初始浓度达到27.2mg/L时, 固定化菌的藻毒素去除率略有下降,而游离菌的藻毒素去除率则出现明显下降.当MC-LR初始浓度较低时,细胞可利用的碳氮源较少,菌株生长缓慢,藻毒素降解菌的生长繁殖受到抑制,因此其去除率较低.随着MC-LR初始浓度的增大,可利用的碳氮源增多,细胞大幅生长,去除率同时也增大.但是 MC-LR初始浓度继续增大时,可能对菌株的生长有毒害作用,从而抑制了藻毒素降解菌的生长,导致 MC-LR降解率的下降.而固定化菌由于菌密度较大,且活性炭纤维具有较强的物理吸附能力,能将藻毒素吸附在活性炭纤维上,为藻毒素降解菌充分利用藻毒素创造了条件.因此在所实验的 MC-LR初始浓度范围内,固定化菌对 MC-LR的去除率均高于游离菌.由此可见,固定化藻毒素降解菌可以在较宽的MC-LR浓度范围内较好地去除MC-LR.

3 结论

3.1 在藻蓝蛋白的提取纯化过程中 MC-LR主要分布于超滤滤液中,含量达到总含量的81.23%,这对藻蓝蛋白的提取纯化及 MC-LR的去除具有一定的理论指导意义.

3.2 采用(1+9)盐酸预处理的活性炭纤维,其固定化效果最佳,对MC-LR的去除率达到89.2%,比不经任何预处理的活性炭纤维固定化菌高出 36.0%.表明活性炭纤维在使用前进行预处理是必要的.

3.3 将活性炭纤维作为固定化载体,将藻毒素降解菌固定化,固定化载体上的菌体密度大,在不同的温度、pH、MC-LR初始浓度条件下,固定化菌的藻毒素去除率均高于游离菌.

3.4 将活性炭纤维作为藻毒素降解菌的固定化载体,既有很好的生物相容性,又能降低环境中的不利因素对藻毒素降解菌降解活性的抑制.在本实验中,最适活性炭用量为10.0g/L,最适pH值为8.0,最适温度为35℃.

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Removal of microcystin-LR by a microcystin-degrading strain immobilized by activated carbon fiber.

YUAN Yuan,

WU Juan, LI Yu-cheng*, WANG Ning (School of Resources and Environmental Engineering, Anhui University, Hefei 230601, China). China Environmental Science,2014,34(2)：403～409

Distribution of MC-LR during the extraction of phycocyanin was studied. A microcystin-degrading strain was immobilized by activated carbon fiber (ACF), and the effect factors, such as the pretreatment methods of activated carbon fiber, dosage of activated carbon fiber, pH value, temperature and the initial concentration of MC-LR were investigated. The results showed that 81.2% of MC-LR existed in the ultrafiltrate during the phycocyanin extraction. The immobilized strain presented significantly better performance in MC-LR removal than the non-immobilized strain. The performance of ACF which was pretreated with (1+9) HCl was much better than others. The optimum removal conditions were as follows: dosage of activated carbon fiber was 10g/L, the temperature was 35℃, the pH value was 8.0, and the initial concentration of MC-LR was 13.6mg/L. Therefore, immobilized strain showed a certain tolerance towards the pH value and the temperature. And MC-LR could be removed effectively in the range of pH5 to pH9, 10℃～35℃.

microcystin-LR；immobilization；activated carbon fiber；removal rate

X703.5

：A

：1000-6923(2014)02-0403-07

袁 媛(1988-),女,河北石家庄人,安徽大学资源与环境工程学院硕士研究生,研究方向为水污染治理.

2013-06-10

国家自然科学基金项目(40972092,41172121);安徽高校省级科学研究项目(KJ2012A006)

* 责任作者, 教授, li-yucheng@163.com