响应曲面法优化桑椹黄酮的超声提取工艺

2014-04-24李建华

湖北工程学院学报 2014年3期

袁玲，李建华

(湖北工程学院生命科学技术学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北孝感 432000)

桑椹 (mulberry)为桑科(Moraceae)植物桑的成熟果穗,在我国资源丰富，能药食两用。桑椹营养丰富，富含多种人体所必需的营养物质[1]，被誉为“第三代水果”。桑椹中含有丰富的黄酮类物质，能够抗脂质过氧化，具有延缓衰老及润肤美容的功效[2]。桑椹黄酮还具有降血糖[3-4]活性和降尿酸[5]活性的作用。

随着桑椹黄酮生物活性研究的深入，提取工艺也需优化。常见黄酮提取方法有溶剂法、微波辅助提取法及超临界流体提取法等[6]。其中超声辅助提取法具有提取时间短、无污染、提取效率高及能耗低等优点。响应曲面优化法(Response Surface Method, RSM)集数学和统计学方法于一体，通过描绘效应对考察因素的响应面，选择较佳的响应区，从而最终回推出自变量取值范围，即最优化实验条件[7]。超声法提取桑椹总黄酮的定性研究已有报道[8]，但还未见响应曲面优化桑椹黄酮的工艺试验。以桑椹总黄酮含量为考察目标，采用超声波法提取，通过响应曲面分析法探讨提取过程中液料比、超声功率以及提取时间对总黄酮得率的影响，优选最佳工艺，预测最高得率，为桑椹黄酮的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验用桑椹采自湖北省孝感市朋兴乡，45 ℃烘干，粉碎过50目筛备用。芦丁标准品，中国药品生物制品检定所。亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇等均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

Cary 60紫外可见分光光度计，安捷伦科技有限公司；DL-480B智能超声波清洁器，上海之信仪器有限公司；SHZ-III循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；HH-4数显恒温水浴锅，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.3 黄酮(以芦丁为标准物)检测波长的确定

首先，准确配制质量浓度为0.20 mg·mL-1的芦丁标准溶液，然后吸取2 mL于10 mL具塞比色管中，加5% 亚硝酸钠溶液0.3 mL，充分摇匀，放置6 min后加入10% 硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入4%氢氧化钠溶液4 mL，再加30%乙醇使总体积为10 mL，摇匀后放置10 min，在波长400～700 nm处扫描，确定其最大吸收波长[9]。

1.4 标准曲线的绘制

取7支10 mL具塞试管，分别准确吸取芦丁标准溶液(0.20 mg/mL)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，按前述检定波长的方法处理各管后，以0管为空白，在最佳波长处测定吸光度，绘制芦丁浓度与吸光度的标准曲线[10]。

1.5 试验设计

在前期单因素实验的基础上，使用Design-Expert软件的中心组合设计(Central Composite Design，CCD)模块中的二次回归正交旋转组合设计，设计一组3因素5水平共计20次的实验(full CCD 设计)，其中析因部分实验次数为14次，星点数为5，保证均一精密性的中心点重复次数手动调整为6，本试验设计的因素及水平见表1。

表1 中心组合设计因素水平表

1.6 桑椹总黄酮的提取与含量测定

准确称取1.00 g干粉末，按照中心组合设计试验中设置的不同提取条件，分别进行超声提取，3 500 r/min离心5 min，抽滤收集各提取条件下得到的提取液，备用。各提取液按1 : 3处理后在最佳波长处测定吸光值，计算样品中黄酮的含量。

1.7 数据处理

实验数据采用Design Expert 8.0软件进行多元回归及方差分析。

2 结果与分析

2.1 黄酮波长检测

将处理好的芦丁标准溶液倒入直径为1cm的石英比色皿中，在Cary 60紫外可见分光光度计中从450 ～700 nm进行扫描，用随机附带的软件绘制的扫描结果如图1所示。

图1 芦丁波峰检测

从图1可以看出，芦丁在可见光区有一明显的吸收峰，仪器随机软件显示，波峰所在波长为504 nm。

2.2 标准曲线

以芦丁标准液和质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，可得芦丁标准曲线如图2。吸光度值y与芦丁质量浓度x(μg·mL-1)在10.0～60.0 μg·mL-1内呈良好的线性关系，回归方程为：

y=0.010x+0.01，相关系数(R2)=0.997。

图2 芦丁质量浓度(μg·mL-1)与吸光值的标准曲线

2.3 试验结果

超声功率、液料比以及提取时间三因素影响桑椹黄酮提取的试验结果如表2所示。

表2 响应曲面分析试验设计方案及结果

2.4 模型的建立与方差分析

利用Design-Expert软件对试验结果(表2)进行回归及方差分析，发现本试验结果符合三次方模型，经过响应曲面法的拟合计算得出该模型的决定系数R-Squared为0.961 6，表明该模型具有一定的可信度；校正系数RAdj=0.939 1，表明在黄酮含量总的变异中，有93.91%是由独立变量引起的。失拟项不显著，表明该模型能够对桑椹黄酮的提取进行预测和分析。

桑椹黄酮提取的方差分析结果见表3。通过方差分析可对模型的精确性做进一步的判断，该模型的F值为42.87，因误差而接受该模型的概率不到0.000 1，表明模型的可信度很高，具有重要的参考价值；如果以0.05作为显著性标准的话，在该模型中，A、B、C、B2、ABC和A2B表示显著模型项，表明超声功率、液料比和提取时间是影响桑椹黄酮提取的关键性因素。

优化可得简化的回归方程为：R=0.115 79 + 0.015 620A+0.440 82B+0.097 522C-5.544 79×10-5AC-3.460 05×10-3B2- 5.280 99×10-6ABC-6.318 03×10-8A2B。这里R表示每克干桑椹提取黄酮的mg数。

2.5 参数优化与验证

在Design Expert 8.0软件的优化模块中，将优化标准设置为最大值，求解得R的最优值是18.85 mg·g-1，预测的最佳实验条件为：超声功率315W，液料比60 mL :1 g，提取时间12 min。为检验优化条件的准确性，按照上述优化过的工艺参数，重复试验4次，得其平均值为18.12 mg·g-1，与预测值相差3.87%，实验值与预测值基本吻合。在优化条件下做2次提取，结果表明桑椹黄酮的一次提取得率达81.6%～81.9%。

3 结论与讨论

采用响应曲面分析，研究了超声提取桑椹中总黄酮的影响因素及最佳工艺条件，得到了各因素的最佳范围，验证实验结果表明该条件下黄酮的平均提取率为18.12 mg/g。殷浩等[11]研究发现随着桑椹的发育成熟，红果2号和蜀椹1号中的总黄酮含量呈现双峰变化，含量最高分别达到0.313%、0.444%。吴祖芳[1]采用分光光度法测得桑椹黄酮类物质含量0.41%。本试验中测得黄酮含量较高，可能与桑椹品种和采摘时间有关，也可能与优化工艺有关，可做进一步试验。

与传统法相比，优化后的超声提取显著提高了桑椹黄酮的得率，缩短了提取时间，该提取工艺稳定环保，有明显的优势和较大的应用前景。