微生物协同发酵生产海鲜调味料的技术研究

2014-04-24赵祥忠张合亮杨晓宙

中国酿造 2014年5期

赵祥忠，张合亮，杨晓宙

（1.齐鲁工业大学食品与生物工程学院，山东济南 250353；2.国家海产贝类工程技术研究中心，山东威海 264200）

近年来，我国贝类的养殖发展迅猛，贝类加工过程中产生了大量的下脚料，主要包括贝类煮汤、贝类裙边、性腺和内脏团等[1-2]。由于贝类深精加工技术滞后，导致这些富含优质蛋白的原料仅用于生产附加值较低的饲料产品，造成贝类资源的极大浪费[3-4]。采用微生物发酵技术，可以将这些贝类下脚料制成富含氨基酸态氮的纯天然的海鲜调味配料，天然海鲜调味料具有天然海产贝类的特殊风味，味道鲜美，口感浓厚，可以加强食品风味，而且氨基酸态氮和多肽的含量较高[5-6]。微生物发酵法摒弃了传统的人工调配合成香精香料的方法，提高了产品的安全性，符合现代人天然、绿色、健康的生活理念[7]。对这些贝类资源进行综合开发利用，可以为人类提供理想的海洋食品及海洋药物，可创造出宏观的经济效益，将有助于推动我国海洋产业的迅速发展[8-9]。本研究以贝类下脚料为原料，采用微生物协同发酵，以期得到新型的海鲜调味料，对海鲜下脚料深度加工利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

扇贝下脚料、鲍鱼下脚料：荣成爱伦湾食品有限公司；米曲霉（Aspergillus oryzae）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）：齐鲁工业大学微生物菌种保藏中心。

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、琼脂：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、氯化钠、氢氧化钠，均为分析纯：天津广成化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-S4数显恒温水浴锅：常州普天仪器制造有限公司；SHP-150型恒温培养箱、LQZ-211型恒温振荡培养箱：上海精宏仪器设备有限公司；SW-CJ-2G型双人超净工作台：苏州净化空调设备有限公司；7230G型电子天平：上海越平科学仪器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ高压蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；Foss Kjeltrc 2300自动凯氏定氮仪：福斯（中国）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 测定方法

粗蛋白：采用凯氏定氮法[10]。

可溶性蛋白：取不同时期的发酵液，调节pH值为4.5，在3 500r/min的条件下离心除去未溶解的大分子蛋白质和菌体，测定清液中的总氮和氨基酸态氮含量，两者之差乘以6.25即为可溶性蛋白质含量。

氨基酸态氮：采用甲醛滴定法[4]。

1.3.2 海鲜调味料的生产工艺流程

贝类下脚料→粉碎→溶解→灭菌→发酵→灭菌→过滤→产品

工艺操作要点：

贝类下脚料用粉碎机粉碎至100目以下，加蒸馏水制成250g/L的贝类下脚料溶液，添加1.5%的葡萄糖，调节pH值为7.0，灭菌后加入5%的米曲霉和热带假丝酵母（1∶1，m/m）混合液，在35℃下培养48h，升温至50℃发酵72h，发酵液灭菌后过滤即为贝类海鲜调味料。

1.3.3 试验菌株的确定

米曲霉（Aspergillus oryzae）能产生丰富的蛋白酶系，包括酸性、中性和碱性蛋白酶，在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸。其稳定性高，耐温性较好，广泛应用于发酵工业中[11-12]。

热带假丝酵母（Candida utilis）可以分泌淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等多种酶，生长过程中产生更多的蛋白质和B族维生素，不需要加入任何生长因子即可生长[13-15]。

试验中配制250g/L的贝类下脚料溶液，调节pH值至7.0，分别加入5%的米曲霉、热带假丝酵母和复合菌株，在35℃下培养48h，升温至50℃发酵72h，测定发酵液中可溶性蛋白质和氨基酸态氮含量。

1.3.4 协同发酵条件优化

对影响复合菌株协同发酵的贝类下脚料质量浓度、复合菌株接菌量、发酵液pH、发酵温度和发酵时间进行单因素发酵研究，并对复合菌株协同发酵的条件进行优化。

2 结果与讨论

2.1 发酵菌株的确定

分别进行米曲霉和热带假丝酵母单菌株发酵，配制质量浓度为250g/L的贝类下脚料溶液，添加1.5%的葡萄糖，调整pH值为7.0，灭菌后接入6%的米曲霉菌株（或6%的热带假丝酵母），在35℃下培养48h，升温至50℃发酵80h；米曲霉和热带假丝酵母协同发酵条件同上，接种量为6%（米曲霉和热带假丝酵母比例1∶1），单菌种及复合菌种发酵结果分别见图1～图3。

由图1可知，米曲霉发酵过程中，可溶性蛋白、氨基酸态氮均经历了先增加后减少的过程。其中可溶性蛋白在16h时，含量达到最大值18.22%，之后大幅下降，发酵初始阶段，蛋白会大量溶出；16h后，菌体产生大量的蛋白酶，分解溶液中蛋白质，从而使可溶性蛋白含量逐渐减少。氨基酸态氮含量前期增加缓慢，在32h后氨基酸态氮含量迅速增加，到64h时氨基酸态氮含量达到最大值1.14%，之后因菌体生长仍需氨基酸，使溶液中氨基酸含量出现了小幅的下降。

图1 米曲霉对可溶性蛋白质和氨基酸态氮含量的影响Fig.1 Effect of Aspergillus oryzae on the content of soluble protein and amino acid nitrogen

图2 热带假丝酵母对可溶性蛋白质和氨基酸态氮含量的影响Fig.2 Effect of Candida tropicalis on the content of soluble protein and amino acid nitrogen

由图2可知，热带假丝酵母发酵过程中，可溶性蛋白、氨基酸态氮变化趋势同米曲霉基本一致。可溶性蛋白在24h时含量达到最大值20.05%，24h后可溶性蛋白含量逐渐减少。48h后氨基酸态氮含量增加迅速，到72h时氨基酸态氮含量达到最大值0.45%。

图3 协同发酵对可溶性蛋白质和氨基酸态氮含量的影响Fig.3 Effect of cooperative fermentation on the content of soluble protein and amino acid nitrogen

由图3可知，2种发酵剂按1∶1的比例复合发酵有助于贝类下脚料的降解；当发酵到16h时，发酵液中可溶性蛋白质达到最大值21.65%，以后逐渐减低，64h后氨基酸态氮含量上升趋势变缓，最大值出现在72h，为1.30%。

对比单菌株发酵和协同发酵对可溶性蛋白质含量和氨基酸态氮含量的影响，确定采用米曲霉和热带假丝酵母按1∶1（m/m）比例复合后进行发酵。

2.2 微生物协同发酵条件优化

2.2.1 贝类下脚料质量浓度对氨基酸态氮含量的影响

分别配制100g/L、125g/L、150g/L、175g/L、200g/L、225g/L、250g/L和275g/L的贝类下脚料溶液，调节pH值至7.0，加入6%的复合菌株，在35℃下培养48h，升温至50℃发酵72h（35℃条件下培养是为了使复合菌株快速增长，扩大菌株的数量，50℃发酵即在对数期产酶，酶解贝类下脚料），测定发酵液中氨基酸态氮含量，结果见图4。

图4 贝类下脚料质量浓度对氨基酸态氮含量的影响Fig.4 Effect of shellfish scraps concentration on amino acid nitrogen content

由图4可知，随贝类下脚料溶液质量浓度的不断增加，氨基酸态氮含量逐渐提高，当质量浓度接近250g/L时，上升趋势趋于平缓，继续增加下脚料溶液的质量浓度，氨基酸态氮含量基本保持不变。这说明当下脚料质量浓度超过最适底物质量浓度后，发酵菌株质量浓度相对变稀，而且过高的下脚料质量浓度会限制微生物的运动，限制了微生物的发酵。因此，将250g/L作为最佳的贝类下脚料发酵质量浓度。

2.2.2 复合菌株接种量对氨基酸态氮含量的影响

配制质量浓度为250g/L的贝类下脚料溶液，调整pH值为7.0，分别接入1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的复合菌株，在35℃下培养48h，升温至50℃发酵72h，结果见图5。

由图5可知，随复合菌株接种量的不断增加，溶液中氨基酸态氮含量逐渐提高，当接菌量为6%时，溶液中氨基酸态氮含量达到最高值，继续增加接菌量，氨基酸态氮含量反而出现下降趋势。这是因为接入过多的微生物后，其生长过程需要消耗游离态的氨基酸，导致溶液中氨基酸态氮含量降低。因此，确定6%作为复合菌株的最佳接种量。

图5 复合菌株接种量对氨基酸态氮含量的影响Fig.5 Effect of multi-culture starter inoculation on amino acid nitrogen content

2.2.3 pH值对氨基酸态氮含量的影响

配制质量浓度为250g/L的贝类下脚料溶液，分别调节pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，接入6%的复合菌株，在35℃下培养48h，升温至50℃发酵72h，结果见图6。

图6 pH值对氨基酸态氮含量的影响Fig.6 Effect of pH on amino acid nitrogen content

由图6可知，pH值对氨基酸态氮含量的影响较大，氨基酸态氮含量先随pH值的增大逐渐升高，pH值为7.0时接近最高值，pH值继续增大，氨基酸态氮含量反而下降。这是因为每种微生物都有其最适的酸碱环境，偏离了最适生长的pH，其生长、繁殖和产酶能力都会迅速降低。因此，确定复合菌株发酵的最佳pH值为7.0。

2.2.4 发酵温度对氨基酸态氮含量的影响

配制质量浓度为250g/L的贝类下脚料溶液，调节pH值7.0，加入6%的复合菌株，在35℃下培养48h，再调节温度分别为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃发酵72h，结果见图7。

由图7可知，随发酵温度的不断上升，氨基酸态氮含量先升后降，在50℃时氨基酸态氮含量最高，说明复合菌株生长过程中产生的酶在50℃时酶活力最大，较低和较高的发酵温度都不利于酶解反应的进行。因此确定复合菌株的最佳发酵温度是50℃。

2.2.5 发酵时间对氨基酸态氮含量的影响

配制质量浓度为250g/L的贝类下脚料溶液，调节pH值7.0，加入6%的复合菌株，在35℃下培养48h，再在50℃下发酵48h、56h、64h、72h、80h、88h、96h，结果见图8。

图7 发酵温度对氨基酸态氮含量的影响Fig.7 Effect of temperature on amino acid nitrogen content

图8 发酵时间对氨基酸态氮含量的影响Fig.8 Effect of time on amino acid nitrogen content

由图8可知，发酵时间对氨基酸态氮含量的影响也较大，氨基酸态氮含量先随发酵时间的延长逐渐升高，72h时接近最高值，继续延长发酵时间，氨基酸态氮含量反而有所下降。这是由于部分游离氨基酸转化成了菌体蛋白，因此，确定复合菌株的最佳发酵时间为72h。

2.2.6 正交试验确定最佳的发酵工艺条件

在单因素试验基础上，以氨基酸态氮为考察指标，选取下脚料溶液质量浓度、复合菌株接菌量、发酵温度和发酵时间进行L9（34）正交试验，因素与水平见表1，结果与分析见表2，方差分析见表3。

表1 发酵工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for fermentation process optimization

由表2可知，R值大小决定了这4个因素对氨基酸态氮含量影响的主次顺序是A＞B=D＞C，即影响氨基酸态氮含量最大的因素为下脚料溶液的质量浓度，其次是复合菌株接菌量和发酵时间，影响最小的是发酵温度；最佳组合是A2B1C2D2，在此最佳条件下进行验证试验，结果A2B1C2D2组合的氨基酸态氮含量达到1.35%。确定最佳的发酵条件为贝类下脚料溶液质量浓度250mg/L，接菌量5%，pH值为7.0，发酵温度50℃，发酵时间72h，此时水解液中氨基酸态氮含量为1.35%。

表2 发酵工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for fermentation process optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3方差分析结果可以看出，贝类下脚料溶液质量浓度对氨基酸态氮含量有显著影响（P＜0.05）。

3 结论

利用扇贝和鲍鱼加工过程中的下脚料，采用米曲霉和热带假丝酵母按照1∶1（m/m）复合并进行协同发酵，在下脚料溶液质量浓度为250g/L，pH值为7.0，复合菌株接种量5%的条件下，在35℃培养48h再升温至50℃发酵72h，制得了氨基酸态氮含量为1.35%的贝类海鲜调味料。本研究采用微生物发酵法制备海鲜调味料，提高了产品的安全性，符合社会趋势的要求，同时通过对海鲜下脚料深度加工利用，使海洋资源得到充分开发，创造出一定的经济价值。为更好地降低海鲜调味料中苦味并提高鲜味，需进一步加强风味酶脱苦和美拉德反应增鲜研究。

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