葡萄花色苷的合成及稳定性研究进展

王维茜，邓洁红 *，魏一枝，刘永红

（1.湖南农业大学 食品科学技术学院 食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；2.湖南生物机电职业技术学院，湖南 长沙410127）

随着葡萄酒业的规模化和快速发展，葡萄酒业已遍布全球五大洲，葡萄酒的生产大国也不再局限于西欧国家，在美洲、大洋洲、非洲和亚洲也崛起了一些葡萄酒生产大国。国际知名的酿酒葡萄品种有黑皮诺（Point Noir）、佳美（Gamay）、西哈（Syrah）、歌海娜（Grenache）、慕尔维特（Mourvedre）、佳丽酿（Carignan）、美乐（Merlot）、吕丽珠（Cabernet Franc）、赤霞珠（Cabernet Sauvignon）、马尔贝克（Malbec）、塔娜（Tannat）、神索（Cinsaut）等，国内葡萄品种比较匮乏，研究比较多的葡萄品种有巨峰（Kyoho）、山葡萄（Vitis amurensis）、刺葡萄（Vitis davidiiFoex）等。不同葡萄品种花色苷含量有显著差异，花色苷具有抗氧化作用，可以清除体内的自由基；能降低高血脂水平，改善高甘油脂脂蛋白胆固醇含量；具有抗肿瘤、抗变异、抗过敏、保护胃粘膜等多种生理功效。目前，绝大部分的葡萄都用来生产葡萄酒和葡萄汁，而花色苷含量高的葡萄皮渣变成生产废料，是一种巨大的能源浪费，开发利用葡萄皮中花色苷具有非常重要的实用价值和广阔的应用前景。

1 葡萄花色苷的研究概况

1.1 葡萄花色苷的结构及性质

自然条件下游离的花色素极少，在植物中花色苷均以糖苷的形式存在。花色苷的结构母核是2-苯基苯并吡喃阳离子，如图1所示。重要的花色苷有6类，即花青素、飞燕草色素、锦葵素、芍药素、牵牛花色素和天竺葵色素，常与1 个或多个葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖等通过糖苷键与花色素C环3位或5位羟基相连形成花色苷；与花色素结合的二糖有槐糖、芸香糖；三糖有2G-木糖苷芸香糖、葡萄糖苷芸香糖。最常见的4种花色素配糖形式是3-单糖苷、3-双糖苷、3，5-二糖苷、3，7-二糖苷[1]。一般认为花色素呈色反应其颜色差异决定于取代基的不同。最常见的酰化形式是酰化取代基与C-6位的羟基酯化或与C-3位的糖键合，能引起酰化的酸主要有咖啡酸、对香豆酸、对羟基苯甲酸、芥子酸、阿魏酸、苹果酸、丙二酸、乙酸和琥珀酸。AMICO V等[2]认为红葡萄酒之中的花色苷含量与组成，与葡萄的品种、地理位置、季节、成熟度、产量都有关系；即使是同一个种内的不同品种，花色苷的组成与分布也有差异，并使品种具有其颜色特征。欧亚种葡萄中花色苷主要有5种，分别为锦葵素、甲基锦葵素、花青素、二甲基花青素、芍药素。红葡萄皮中的花色苷主要为锦葵素3-O-葡萄糖苷、芍药素3-O-葡萄糖苷、锦葵素3-O-（6-O-乙酰）-葡萄糖苷[3]。花色苷溶于水和乙醇，不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂。遇醋酸铅试剂会沉淀，并能被活性炭吸附。其颜色随pH值不同而变化，在酸性条件下呈红色，在中性、近中性条件下呈无色，在碱性条件下呈蓝色。

图1 花色苷的化学结构Fig.1 The chemical structure of anthocyanins

1.2 葡萄花色苷的合成

许多研究发现花色苷合成的最初前体物质为苯丙氨酸，这一过程极其复杂，而且由不同的酶催化。花色苷的生物合成有特定的调节机制，并受两套基因控制，即结构基因和调节基因。结构基因即直接编码色素合成的酶，是所有植物共有的，通过转录起作用。相关酶包括花色苷合成酶（anthocyanins synthetase，ANS）、二氢黄酮醇-4-还原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR）、查尔酮合成酶（chalonesynthase，CHS）、查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）、黄烷酮-3-羟基化酶（flavanone-3-hydroxylase，F3H）、类黄酮葡萄糖基转移酶（UDP-glycose：flavonoid glycosyltransferase，UFGT）。调节基因即调节结构基因活性和表达，决定了花色苷积累的时间和分布。相关酶包括苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyas，PAL）和类黄酮-3-O糖基转移酶（3-O-glycosyltransferases，3GT）、肉桂酸-4-羟基羧化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）、对香豆酰-CoA连接酶（4-coumaryl：CoA ligase，4CL）、黄酮合酶（flavonol synthase，FS）；异黄酮合酶（isoflavone synthase，IFS）、黄烷酮-3′-羟基化酶（flavanone-3-hydroxylase，F3′H）、黄烷酮-3′,5′羟基化酶（flavanone-3′,5′-hydroxylase，F3′5′H）、黄酮醇合成酶（flavonol synthase，FLS）等[4]。苯丙氨酸解氨酶（phenylalaninammonia-lyase，PAL）是多酚物质代谢途径中的一个限速酶，F3′H是过氧化物酶，催化二氢黄烷酮生成二氢山奈酚（dihydrokaempferol，DHK），二氢黄酮醇-4-还原酶（dihydro flavonol-4-reductase，DFR）是催化二氢山奈酚、二氢杨梅黄酮（dihydromyricetin，DHM）和二氢槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）分别是生成无色天竺葵苷元、无色飞燕草色素和无色花青素的关键酶，查尔酮合成酶（CHS）是催化生成苯基苯乙烯酮的关键酶，花色苷合成酶（ANS）催化无色花青素转变为有色花青素，F3′H和F3′5′H决定花色苷的羟化模式，最后3GT催化花青素与糖基形成花色苷[5]。花色苷的合成途径分3个步骤：第一步由PAL催化苯丙氨酸生成肉桂酸，再形成香豆素-CoA；第二步由香豆素-CoA和丙二酰-CoA反应生成无色的柚苷配基；第三步由柚苷配基还原成花白素，生成的最终产物花青素经3GT催化与糖缩合形成花色苷贮存在液泡中[6]。花色苷合成途径见图2，气候条件、栽培条件对花色苷的形成与积累有很大影响。一般认为随着海拔高度和纬度的增加，紫外线照射加强，果实的着色率和着色度会明显提高。昼夜温差对花色苷合成和葡萄浆果着色影响较大。光照、较低的温度、适度限制灌水都能促进花色苷的形成。而高施氮肥会抑制花色苷的形成，过多地施氮肥会导致果实的着色不良[7]。

图2 花色苷合成途径Fig.2 The way of anthocyanins synthesis

2 葡萄皮花色苷稳定性的影响因素

花色苷有其独特的缺电子结构，极其不稳定。花色苷的4种结构变化形式为蓝色的醌式碱（A）、红色的二苯并吡喃阳离子（AH+）、无色的甲醇假碱（B）、无色的查尔酮（C），这四种物质的相互转化能造成花色苷颜色的变化，稳定性也直观的体现在颜色的变化上。花色苷的稳定性受到许多因素的影响，如光和热、pH值、金属离子、酶、糖类和等。

2.1 光和热

花色苷在不同温度下的降解遵循一级动力学反应规律，二苯基苯并吡喃阳离子（AH+）的失电子过程：AH+→A是一个放热反应，而水解反应AH+→B和开环反应B→C均为吸热反应，因此当温度升高时，平衡向着无色的查尔酮（C）和甲醇假碱（B）形式转化，但当冷却和酸化时，醌式碱（A）和甲醇假碱（B）还可转变成阳离子（AH+）形式，而查尔酮（C）则很难再转化为阳离（AH+）子形式。在光照条件下，单糖苷、非酰化的二糖苷、酰基化的二糖苷稳定性依次增大[8]。FURTADO P等[9]提出光降解的最终产物与热降解的最终产物相同，但是两者的降解途径不同。光降解的途径可能为：花色苷首先降解生成C4 羟基中间产物，然后该中间产物在C2 位水解开环，生成查尔酮（C），最后查尔酮迅速降解，生成苯甲酸及2，4，6-三羟基苯甲醛等终产物。

2.2 pH值

花色苷易受pH的影响，一般在酸性条件下较稳定，在中性或碱性条件下易降解，但是，含有2个或2个以上酰基的花色苷在整个pH范围内都表现出很好的颜色稳定性。花色苷在pH＜2时，主要以红色阳离子（AH+）的形式存在；pH为4～5时，主要为无色醇型碱（B）或查尔酮（C）形式；pH值＞6时，主要为蓝色醌式假碱（A）形式。SADILOVA E等[10-11]对pH 1.0和pH 3.5 条件下的矢车菊素-3-葡萄糖苷的热降解产物进行了分析，发现在2种pH条件下都会产生原儿茶酸和2,4,6-三羟基苯甲醛2种终产物，但只有在pH值为3.5条件下能够检测到中间产物查尔酮（C），在pH值为1.0条件下没有发现，这一现象的原因可能是查尔酮在pH 1.0条件下不稳定，说明pH会对花色苷热降解途经产生影响。

2.3 氧化剂及过氧化剂

花色苷在酸性和中性条件下的氧化降解途径不同。在pH 1～3的酸性溶液中，O3或H2O2生成自由基类物质，并与花色苷结合生成花色苷-H2O2复合物，H2O2与花色苷的C2位发生亲核反应，使C2和C3之间的共价键断裂，生成苯甲酰苯基乙酸酯，该酯极易在碱性条件下发生水解，形成酚酸、苯甲酸和2,4,6-三羟基苯乙酸。在pH 6～7的中性溶液中，锦葵素-3,5-二葡萄糖苷（malvidin-3,5-di-glucoside）在加热条件下先转化为醌式碱，进而生成香豆素衍生物3,5-二葡糖基-7-羟基香豆素[3,5-di-（O-β-D-glucosyl）-7-hydroxycoumarin]，运用此法可判断糖取代基的位置[12]。OZKAN M等[13]实验发现，H2O2可以促使花色苷降解，H2O2主要通过3个反应，生成·OH，使花色苷的苯环发生降解最后生成CO2和H2O，并得出H2O2主要是通过两种途径来影响花色苷降解：一是H2O2裂解生成大量的具有非偶电子的基团或原子即自由基和过氧氢根离子HOO－；二是大量醌类物质的生成。

2.4 金属离子

金属离子对花色苷具有一定的辅色效果，与Ca2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Sn2+或其他金属离子的络合能对颜色能起稳定性作用。金属离子对不同种类的花色苷的影响不同，有增色效应也有破坏作用，同种离子对不同种花色苷的影响也有差异，这与花色苷本身的分子结构和浓度有很大关系。研究发现只有在B-环上含有邻位羟基的花色苷才能与金属离子络合。因此，可以通过向花色苷添加某种金属离子，再观察其最大吸收波长是否移动，来区别具有这种B-环上含有邻位羟基的花色苷和其他普通花色苷[14]。虽然金属离子对花色苷的稳定性具有一定增强作用，但这一效应也不是有益无害的，主要体现在增色的同时形成的金属-单宁络合物可导致花色苷褪色。

2.5 酶

在花色苷的降解过程中主要的酶有2种：一是糖苷酶（glyeosidase）可水解花色苷得到游离的糖和花青素，花青素很不稳定，可自发生成无色的物质。葡萄糖、葡萄糖-δ-内酯和葡萄酸是糖苷酶的竞争性抑制剂。二是多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）通过偶合氧化机理作用于作用于存在邻-二酚羟基的花色苷，产生的中间产物-邻醌能使花色苷转化为氧化的花色苷及其降解产物。多酚氧化酶（PPO）的活性可有效的被SO2、亚硫酸盐、单宁、苯肼和半胱氨酸抑制。其他参与降解的酶还有过氧化物酶和果胶酶[15]。KADER F等[15]采用Sephadex G-25柱层析将咖啡酸的氧化产物咖啡酸醌（caffeic acid O-quinone，CQ）进行了纯化，然后与天竺葵色素-3-葡萄糖苷反应，采用紫外可见光谱、高效液相等化学分析方法进行鉴定，发现产物中有咖啡酸和残存的天竺葵色素-3-葡萄糖苷，这是因为竺葵素-3-葡萄糖苷不是邻位酚羟基结构，所以不会生成咖啡酸，因此推断出咖啡酸是由邻苯二醌咖啡酸生成的，并证明了多酚氧化酶（PPO）本身不能促进花色苷的降解，而是当有咖啡酸等酚类存在时，多酚氧化酶能促进多酚生成O-醌类化合物，这一中间产物与花色苷反应生成花色苷-O-醌的缩合物，从而加快花色苷的降解[16]。

2.6 糖

在高浓度的糖存在时，水分活度降低，花色苷生成假碱式（B）的速度减慢，因此花色苷的颜色得到了保护；但是在低浓度的糖存在时，花色苷的降解或变色却加快。果糖、乳糖、阿拉伯糖和山梨糖的这种作用比蔗糖、葡萄糖和麦芽糖表现的更强[17]。CAO S等[18]研究发现，因为蔗糖为二糖，首先分解生成葡萄糖和果糖后，才能生成糠醛，而己酮糖（ketohexose）较己醛糖（aldohexose）更易转化为糠醛，所以糖对花色苷的降解速率表现为果糖＞蔗糖＞葡萄糖。

2.7 SO2

低浓度的SO2用作防腐剂，对花色苷具有稳定作用，因其可与抗坏血酸有效地结合。SO2虽然具有这样的稳定化作用，但实际上却由于生成亚硫酸盐使色素褪色。SO2对花色苷的漂白作用分为可逆或不可逆。当SO2用量为500～2 000μg/g时，是可逆的，在后续的加工处理中，能通过大量水洗脱后恢复颜色。SO2在有机酸的作用下形成亚硫酸氢根，其对花色苷C4亲核攻击生成无色的花色苷亚硫酸盐复合物[19]。由于无色的花色苷亚硫酸盐复合物形式仅和阳离子（AH+）形式存在平衡，可以得出SO2比溶液的pH对葡萄酒花色苷的褪色作用还要大。

2.8 亲核试剂

非酰化和单酰化的花色苷对C2位和C4位上的亲核进攻特别敏感。对于氨基酸和碳亲核试剂，这一进攻往往发生在花色苷亲电的C4位上。这些生成物具有很高活性，根据C4位上取代基的性质还会进一步发生反应，最终使花色苷褪色。研究表明[20]，C4位被甲基或苯基取代的阳离子（AH+）对亲核进攻具有抵御作用，这表明花色苷稳定化的有效措施是使C4位被取代。花色苷母核结构上的羟基和糖苷基上的羟基，都可以与一个或几个咖啡酸、香豆酸、脂肪酸、对羟基苯甲酸和阿魏酸通过酯键结合形成酰基化的花色苷，从而增强其稳定性。BKOWSKA-BARCZAK A等[21]通过实验研究发现酰化能增强花色苷的稳定性其作用机理是通过花色苷吡喃环的酰基堆积钝化花色苷对亲核试剂的敏感性，从而阻止花色苷从红色的阳离子（AH+）水解成无色的查耳酮（C）或蓝色的醌酮（A）。

2.9 抗坏血酸

OZKAN M[22]研究发现抗坏血酸本身并不会使花色苷的降解，而是抗坏血酸的降解产物脱氢抗坏血酸、H2O2和糠醛使花色苷发生了降解反应。花色苷对抗坏血酸的耐性与抗坏血酸的浓度和反应体系的温度有关。低温条件下，抗坏血酸对花色苷具有保护作用；高温处理时，花色苷在低浓度的抗坏血酸中稳定，在高浓度抗坏血酸中加速降解。还有研究表明在花色苷降解过程中，抗坏血酸和氧起协同作用，在有Cu2+存在的情况下也能加速花色苷的降解。因此，在花色苷的生产或富含花色苷产品的加工处理过程中，不宜用抗坏血酸作为抗氧化剂。

3 提高葡萄皮花色苷稳定性的方法

常见花色苷经提纯后稳定性差、极易变色。然而，自然生化条件下，几乎所有花色苷在植物组织中的都是非常稳定的，特别是阳光和温度对其并没有造成影响，这一现象说明花色苷还是可以通过某些方法来提高稳定性的。目前国内外可用来提高花色苷稳定性较好的方法有分子内或分子间辅色、化学改性、生物工程和组织培养技术。

3.1 分子内辅色

通过花色苷分子内基团起到的稳定作用称之为分子内辅色作用。辅色作用的机理是阻止水化，现已发现了数种在中性或微酸性水溶液中保持稳定的花色苷衍生物，这些衍生物结构上的共同点在于在花色苷的C3、C5、C7位上连接有2个或2个以上酰化糖苷基团，使花色苷因水化平衡而失色的活化能增大，从而阻止有色的花色苷转化成无色的假碱（B）[23]。例如符合类似该结构的二咖啡酰飞燕草色素3，7，3-三葡萄糖苷在整个pH范围内表现出相当好的稳定性，这是一种典型的分子内辅色，其机理为该分子结构中咖啡酸的芳香基团与母核上的芳香基团通过上下叠加的π-π共轭作用和极性基团的氢键连接形成高空间阻碍作用，从而提高分子的稳定性。

3.2 分子间辅色

分子间辅助成色机理为辅色剂分子中含有丰富电子，这些电子与阳离子（AH+）相互作用，避免水的亲核攻击，使辅色素与花色苷分子以氢键和非共价键结合形成水平（头尾连接）或π-π共轭垂直层叠的“花色苷-辅色素”复合物[24]，影响体系的能级跃迁，从而使花色苷的成色效果加强，同时最大吸收波长向长波方向移动。钟瑞敏等[25]从玫瑰香葡萄色素中提取出锦葵色素-3-葡萄糖苷和香豆酰锦葵色素-3-葡萄糖苷，添加β-羟乙基芦定酯30后分别测量最大吸收波长，前者的红移量为20nm，颜色强度为原有的102%，后者的红移量为26nm，颜色强度为原有的105%。这类辅色剂包括多糖、金属离子、黄酮、生物碱、有机酸、氨基酸、核苷酸、及花青素本身。BARANAC J等[26]通过实验研究发现，将分别含有60mg/mL和120mg/mL花色苷的糖浆置于20℃光照条件下，2种糖浆质量浓度下花色苷的半衰期分别是29周和33周，由此得出加大花色苷的添加量可以提高色素本身的稳定性这一结论。在一定条件下，花色苷的浓度越大，或花色苷甲基化和糖基化的程度越大，或辅色素与花色苷的摩尔比越大，辅助成色作用的效果越显著[27]。

3.3 化学改性

通过分子改性、化学修饰可以提高花色苷的稳定性。大部分天然花色苷与植物组织分离后不稳定的原因除了失去了自然生化条件外，主要还是因为花色苷配基C4上和C8上没有基团，这两个位置具有较大活性，在温和条件下容易受到SO2和VC等还原性物质或某些亲电基团的攻击，破坏色素生色团的共轭体系[23]。BAKKER J等[28]用间苯二酚、间苯三酚和查尔酮的衍生物、和苯基β-二酮合成了一系列C4和C8位上带有苯基、烷基等基团的花色苷，其颜色从黄、橙到红色，并对SO2、VC和Fe3+表现出抗性。BAKKER J等[28]为提高葡萄酒色泽稳定性在室温条件下用儿茶酸和微量乙醛对葡萄酒中的花色苷进行了化学改性，葡萄酒的色泽稳定性和颜色强度都得到了明显提高。但由于花色苷结构的不同，稳定性提高程度有很大差异，这一变化的机理为儿茶酸和微量乙醛与花色苷在C8形成了新的色素衍生物，改变了体系的共轭强度，使光吸收红移，并形成空间位阻，从而使稳定性得到提高。

3.4 生物工程

大量研究表明，植物合成花色苷与生长时间、光照和其所需的营养物质等因素有关，利用生物工程技术生产稳定性高的花色苷可以克服由于地理环境、气候、季节和病虫害等原因引起的价格和供应的波动。KONCZAK I等[29]通过基因调控使甜薯细胞内的酚酸大量表达，培养出了稳定性高、花色苷含量高、生理活性强的植株。生物工程学家发现了部分天然色素合成的植物基因，通过克隆技术使一些花朵、果实改变颜色。近几年，科学家开始研究合成稳定的3-二咖啡酰槐糖苷-5-葡萄糖苷飞燕草色素的基因，然后通过克隆技术培育能产生高含量花色苷的植株。但飞燕草色素通常表现为深紫色到蓝色，而不是红色[30]，所以大范围色泽的高稳定性花色苷的获取还需同时使用其他方法。

4 展望

葡萄皮色素是一种优良的天然食品色素，安全无毒有较好着色力，主要用于饮料和酒类的调色，也广泛用于果酱、腌制品、果冻、冰激凌、糖果等食品中，可利用其具备的多种生理活性功能开发相应的保健品。从葡萄酒厂的生产废料中提取花色苷具有重要的经济价值。研究花色苷的合成机理，通过控制环境条件来达到提高花色苷产量的目的，研究花色苷稳定性影响因素间的协同作用，通过控制外界因素来提高花色苷在加工应用中的稳定性。

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