川芎嗪对体外精子运动参数的影响

朱晓博刘继红张祥生石红林孔朝辉丁德刚

1.河南省人民医院泌尿外科（郑州 450003）; 2.华中科技大学同济医学院同济医院泌尿外科

川芎嗪对体外精子运动参数的影响

朱晓博1刘继红2张祥生1石红林1孔朝辉1丁德刚1

1.河南省人民医院泌尿外科（郑州 450003）; 2.华中科技大学同济医学院同济医院泌尿外科

目的研究不同浓度的川芎嗪注射液（TMP）体外对人精子运动参数的影响，并初步探讨其可能的作用机制。 方法 20例健康生育男性手淫供精，将上游优化处理的精子，与不同浓度TMP注射液共同孵育10、30、60min，采用计算机辅助精子分析系统观察不同浓度TMP（0.1、1、10mmol/L）体外对精子各运动参数的作用。结果与对照组相比，1mmol/L浓度组，除60min时精子活率[（a+b+c）级精子%]未下降外，其余时间精子活率、前向运动精子百分率[（a+b）级精子%]、平均直线速度（VSL）和平均路径速度（VAP）等观察指标均明显下降，差异均具统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。10mmol/L浓度组，精子活率、前向运动精子百分率、VSL和VAP等观察指标也均明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.01）。与对照组相比，侧摆幅度（ALH）除0.1mmol/L浓度组和1mmol/L浓度组30min时未下降外，余均有下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 川芎嗪体外能显著降低精子运动能力，为男性节育提供了一种新选择。

川芎嗪; 精子能动性; 体外研究

男性节育药物研究已成为当前生殖药物学领域研究的热点。川芎嗪是从我国传统中药川芎根茎中提取出来的一种生物碱，化学名2，3，5，6-四甲基吡嗪，简称四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine, TMP）[1]。TMP可非竞争性拮抗L型电压依赖性钙通道，抑制细胞外Ca2+内流[2]。文献报道，钙通道拮抗剂体外对精子运动参数有显著降低作用[3]。本研究选取20例精液参数正常男性的精液标本，采用计算机辅助精液分析（CASA）系统，研究不同浓度的TMP体外孵育不同时间后对精子运动参数的影响，并初步探讨其可能的作用机制。

材料和方法

一、精子悬液制备

按WHO标准[4]筛选本院男科门诊就诊的20例健康生育男性，年龄22～35岁，禁欲4～7d，手淫取精，精液液化后经上游优化法[4]处理，使其前向运动精子（a级+b级精子）百分率达50%以上，再用Ham’s F10液（Sigma公司）调节精子密度至40×106/mL。

二、川芎嗪溶液的制备

川芎嗪溶液由北京永康药业有限公司提供，用Ham’s F10 液调整川芎嗪溶液的浓度为0.2、2及20mmol/L三种不同浓度。调pH值为7.4，置于冷藏箱中备用。所有溶液使用时均预热至37℃。

三、实验方法及分组

健康生育男性的每份标本分为4组，A组为对照组，加入100μl精子悬液和等量的Ham’s F10液，B、C、D组分别加入100μl精子悬液和等量的不同浓度川芎嗪溶液，使其终浓度分别为0.1、1、10mmol/L。将各支试管轻轻振荡后密闭置于37℃恒温水浴箱中孵育，分别于第10、30、60min时用计算机辅助精液分析系统 （杭州麦迪公司）检测精子的运动参数，每份标本平均观察10个视野。

四、观察指标

主要观察精子的形态，并对各组精子活率[（a+b+c）级精子%]、前向性运动精子百分率（a级+b级精子%）、直线速度（VSL）、平均路径运动速度（VAP）、侧摆幅度（ALH）等指标分别进行分析。

五、统计学处理

统计分析采用SPSS15.0统计软件处理。实验组（B、C、D组）和对照组（A组）比较用两样本差异显著性检验（采用t检验），各实验组之间比较采用方差分析（Q检验），P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

表1 孵育不同时间不同浓度TMP体外对精子运动参数的影响（n=20,±s）

表1 孵育不同时间不同浓度TMP体外对精子运动参数的影响（n=20,±s）

注: 与A组（对照组）比较:*P＜0.05,**P＜0.01

组别 时间(min) 活率(%) a级+b级(%) VSL(μm/s) VAP(μm/s) ALH(μm) A组 10 74.52±9.85 62.25±12.43 34.79±8.13 37.08±7.94 1.00±0.21 30 64.28±16.66 55.10±17.36 28.14±5.74 29.31±6.09 0.91±0.26 60 47.04±14.35 43.96±21.19 31.91±8.32 32.84±8.18 1.10±0.27 B组 10 68.11±10.92 58.96±13.73 24.39±11.91*23.80±6.31*0.99±0.15 30 63.12±13.15 50.56±17.08 28.20±8.41 29.59±9.03 0.96±0.15 60 51.62±12.55 43.87±16.12 24.62±10.92*25.60±10.72 1.08±0.35 C组 10 56.31±17.48*50.18±16.39*27.54±6.53*28.42±6.60*0.96±0.21 30 46.40±19.73*38.01±18.33**22.55±10.17*25.65±11.38*1.00±0.36 60 49.54±14.67 37.21±14.58*20.40±9.03*22.23±9.12*0.99±0.26 D组 10 32.22±14.67**22.07±14.24**13.09±5.40**15.23±5.96**0.93±0.33 30 21.02±8.56**15.60±9.35**10.17±5.60**14.34±6.94**0.88±0.27 60 20.87±5.61**9.26±7.29**8.67±6.48**10.97±6.84**0.82±0.33

一、TMP体外孵育不同时间对精子运动参数的影响

显微镜下观察精子运动，可见随着观察时间的延长，对照组除30～60min时VSL、VAP和ALH未下降外，精子活率、前向运动精子百分率，以及其余时间的VSL、VAP、ALH等观察指标均有下降；0.1mmol/ L浓度组除10～30min时VSL、VAP和30～60min时ALH未下降外，其余观察指标均有下降；1mmol/L浓度组除10～30min时ALH、30～60min时精子活率未下降外，其余观察指标均有下降。10mmol/L浓度组各观察指标均有下降。差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

二、不同浓度TMP对精子运动参数的影响

与对照组相比，0.1mmol/L浓度组，除30min时VSL、VAP及60min时精子活率未下降外，TMP体外孵育不同时间，精子活率、前向运动精子百分率、VSL、VAP等观察指标均有下降，其中10min时VSL、VAP及60min时VSL差异有统计学意义（P＜0.05），余差异无统计学意义（P＞0.05）。1mmol/L浓度组，除60min时精子活率未下降外，其余时间精子活率、前向运动精子百分率、VSL和VAP等观察指标均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），10mmol/L浓度组，精子活率、前向运动精子百分率、VSL和VAP等观察指标均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。与对照组相比，ALH除0.1mmol/L浓度组和1mmol/L浓度组30min时未下降外，余均有下降，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

三、不同浓度TMP体外孵育10min对精子运动参数的影响

预实验提示孵育10min时不同浓度TMP对精子活动率及运动参数影响最为明显，因此选取10min这一时间段来分析TMP对精子运动参数的影响。随着浓度的增加，人精子活率、前向运动精子百分率、VSL、VAP等运动参数下降越明显，与对照组相比，1mmol/ L浓度组差异有统计学意义（P＜0.05）；10mmol/L浓度组差异有统计学意义（P＜0.01）；0.1mmol/L浓度组除VSL、VAP差异有统计学意义外（P＜0.05），其他参数差异无统计学意义（P＞0.05），见图1～3。ALH各浓度组与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），

图1 TMP对人精子活率和前向运动精子百分率的影响

图2 TMP对人精子VSL、VAP的影响

图3 TMP对人精子ALH的影响

讨 论

TMP是从中药川芎中分离提纯出来的一种生物碱单体，可以松弛多种平滑肌[5-7]。文献报道[8]，TMP具有阻滞L型电压依赖性钙离子通道的作用。人类精子膜上存在有电压依赖性钙离子通道（voltagedependent Ca2+channels, VDCCs），VDCCs在精子内Ca2+的调节方面起了重要作用。以往的研究[3]表明，经典钙通道拮抗剂硝苯地平、维拉帕米、尼莫地平、氨氯地平等均明显抑制精子的活力。

研究TMP对精子运动能力的影响，我们选用不同浓度的TMP在体外与经上游优化法处理的精液参数正常的男性精子共同孵育不同时间后，通过CASA系统观察TMP对精子运动能力的影响，结果显示，与对照组相比，1mmol/L和10mmol/LTMP浓度组，精子活率、前向运动精子百分率、VSL、VAP等观察指标均有下降，且随着TMP浓度的升高，差异性越显著，提示TMP对精子运动有抑制作用。至于60min时精子活率未见下降，可能与我们观察例数相对偏少有关。

在影响精子生理活动的离子中，精子细胞内游离钙离子可能是调控精子活动力的关键。钙离子对精子的调节作用是通过精子内钙离子浓度的改变来实现的。存在于精子膜上的特异性钙离子通道在精子内钙离子的调节方面起着重要的作用。VDCCs由α、β、γ3种亚单位组成，其中最重要是α1亚单位，它既是电压感受器，又具有离子选择性，其他亚单位起辅助调节作用[9]。根据α1的电活动特性，可将VDCCs分为L、N、P、Q、R及T等6种，目前主要研究L型和T型通道。随着免疫荧光和分子克隆（RT-PCR）技术的联合运用，大量研究成果可以更加了解存在哺乳动物和人类精子鞭毛区域上VDCCs的类型。Sakata等[10]利用RT-PCR和全细胞膜片钳证实Ca(V)2.3调控小鼠精子的鞭毛运动。Trevino等[11]利用RT-PCR和荧光免疫共聚焦显微镜证实在人精子细胞中存在3种T型VDCC的α1亚单位mRNA表达，其中Ca(V)3.1和Ca(V)3.3定位在鞭毛前段和中段，用HVA抗体可以发现Ca(V)1.3和Ca(V)2.3的存在。因此，VDCCs在对精子运动的发生和过程中起到了关键性的调控作用。精子的运动主要依靠尾部的鞭毛。鞭毛内因子控制鞭毛运动，这些因子主要是钙离子，钙离子负责鞭毛运动的对称性。钙离子调节鞭毛内动力蛋白驱动的微管滑动，但钙离子信号又受钙调蛋白（CaM）和CaM依赖性激酶（CaMK）调节，中心微管和辐是钙离子信号通路的主要成分。鞭毛中钙离子通过中心二微管和辐的复合体（CP/RS）改变动力蛋白臂的滑动，使鞭毛不停地摆动。Munire等[12]发现不育患者精子侧摆幅度与细胞内钙离子的增加呈正相关。TMP抑制精子运动的机制可能与其他经典钙通道阻滞剂一样，通过阻滞L型电压依赖性钙通道，抑制胞膜外钙离子内流，使细胞内钙离子浓度降低所致。其具体机制，有待进一步研究。

以往的研究表明，钙离子以及钙通道不仅能够影响精子的运动，并且对精子发生、成熟、获能及受精等过程均发挥重要作用，它是精子运动的调控者，获能的参与者，顶体反应的第二信使[13]。有理由相信，TMP可能不仅对精子的运动有影响，其对精子的发生、成熟、获能、受精等过程可能均发挥作用，尚有待进一步研究证实。TMP为男性节育药物提供了一个新的选择。

1 Ma L, Fan Y, Wu H,et al.Tissue distribution and targeting evaluation of TMP after oral administration of TMP-loaded microemulsion to mice.Drug Dev Ind Pharm2013; 39(12): 1951-1958

2 Pang PK, Shan JJ, Chiu KW. Tetramethylpyrazine, a calcium antagonist.Planta Med1996; 62(5): 431-435

3 李路, 刘继红. 钙通道拮抗剂体外对人精子运动参数的影响. 中华实验外科杂志 2004; 21(6): 725-727

4 谷翊群, 陈振文, 于和鸣, 等. WHO人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册. 第4版. 北京: 人民卫生出版社, 2001: 53

5 武雪, 高云芳, 赵雪红, 等. 川芎嗪对废用状态下大鼠骨骼肌一氧化氮合酶活性及肌纤维内Ca2+浓度的影响. 中华医学杂志 2012; 92(29): 2075-2077

6 项蔷薇, 罗运春, 朱妍艳, 等. 川芎嗪在哮喘小鼠气道炎症和气道重塑中的作用及其机制. 临床儿科杂志2011; 29(8): 773-776

7 Wong KL, Chan P, Huang WC,et al. Effect of tetramethylpyrazine on potassium channels to lower calcium concentration in cultured aortic smooth muscle cells.Clin Exp Pharmacol Physiol2003; 30(10): 793-798

8 Pang PK, Shan JJ, Chiu KW. Tetramethylpyrazine, a calcium antagonist.Planta Med1996; 62(5): 431-435

9 Koshimizu TA, van Goor F, Tomic M,et al.Characterization of calciumsignaling by purinergic receptor channels expressed in excitable cells.Mol Pharmacol2000; 58(5): 936-945

10 Sakata Y, Saegusa H, Zong S,et al. Analysis of Ca2+currents in spermatocytes from mice lacking Ca(v)2.3 (alpha(1E)) Ca(2+) channel.Biochem Biophys Res Commun2001; 288(4): 1032-1036

11 Trevino CL, Felix R, Castellano LE,et al. Expression and differential cell distribution of low-threshold Ca2+channels in mammalian germ cells and sperm.FEBS Lett2004; 563(1-3): 87-92

12 Munire M, Shimizu Y, Sakata Y,et al. Impaired hyperactivation of human sperm in patients with infertility.J Med Dent Sci2004; 5(1): 99-104

13 Correia S, Oliveira PF, Guerreiro PM,et al. Sperm parameters and epididymis function in transgenic rats overexpressing the Ca2+-binding protein regucalcin: a hidden role for Ca2+in sperm maturation.Mol Hum Reprod2013; 19(9): 581-589

（2014-05-21收稿）

Influence of tetramethylpyrazine on human sperm motility parametersin vitro

Zhu Xiaobo1, Liu Jihong2, Zhang Xiangsheng1, Shi Honglin1, Kong Zhaohui1, Ding Degang11.Department of Urology, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450003, Henan , China;
2. Department of Urology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

ObjectiveTo investigate the effects of the Tetramethylpyrazine (TMP) on human sperm motility in vitro and further explore its possible mechanisms.MethodsSperm samples from 20 healthy fertile men were collected by masturbation, and then they were treated by swim-up technique to produce a spermatozoa solution of high motility. Subsequently they were incubated with different concentration of tetramethylpyrazine solution( 0.1, 1, 10mmol/L)in vitro. Sperm motility parameters at incubation time of 10, 30 and 60min were measured by computer-aided sperm analysis (CASA).ResultsContrast to the control group, In group 1mmol/L and 10 mmol/L,TMP markedly decreased the sperm live rate, progressive motility, VSL, VAP, there were signif cant difference statistically contrast to the control group. But ALH had no signif cant difference statistically contrast to the control group.ConclusionThe data suggest that tetramethylpyrazine can inhibit sperm motility in vitro, which may be a new approach for male contraception.

Tetramethylpyrazine; sperm motility;in vitro

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.08.009

R 979.2