男性不育症患者外周血染色体核型分析的临床意义*

陈 亮 付 杰 于 丽 齐 雯 马京梅 潘 虹 陈 菲张 娜 王 晟 鞠慧岩 薛 晴 左文莉 徐 阳 杨慧霞

北京大学第一医院生殖与遗传医疗中心（北京 100034）

男性不育症患者外周血染色体核型分析的临床意义*

陈 亮 付 杰 于 丽 齐 雯 马京梅 潘 虹 陈 菲张 娜 王 晟 鞠慧岩 薛 晴 左文莉 徐 阳 杨慧霞

北京大学第一医院生殖与遗传医疗中心（北京 100034）

目的基于外周血染色体核型分析，探讨男性不育症患者染色体核型异常的特点及临床意义。方法回顾性分析男性不育患者的外周血染色体核型分析结果，对异常核型的检出率及临床效应进行分析与总结。结果在813例患者中，检出染色体异常55例，检出率为6.76 %。其中，染色体数目异常36例，检出率为4.43%，占总异常数目的65.4%；染色体结构异常17例，检出率为2.09%，占总异常数目的30.91%；假两性畸形2例（核型为46, XX，社会性别为男性）。其中，最常见的染色体数目异常为46, XXY，即克氏征（非嵌合型）；最常见的结构异常为染色体相互易位14例，其中罗氏易位5例，涉及13、14、15、22及22号等染色体。导致男性不育临床效应的直接表现分别为少、弱、畸形精子症以及无精子症等。另外，共检出44例染色体多态性，检出率为5.41%。其中，常染色体多态性11例，检出率为1.35%，占总多态性数目的25%（11/44），表现为随体变异及次缢痕增长。Y染色体的多态性包括大Y核型21例，检出率为2.58%，占多态性总数目的44.73%（21/44）；小Y核型12例，检出率为1.48%，占多态性总数目的27.27%（12/44）。最常见的多态性为Y染色体的变异，其次是常染色体的多态性。染色体多态性导致男性不育临床效应的直接表现为少、弱、畸形精子症及无精子症等。结论染色体异常及多态性变异均可能是导致男性生育力低下的重要因素，主要包括性染色体数目异常（非嵌合克氏征）、Y染色体多态性、染色体倒位及易位等。对于男性不育症，染色体核型分析是重要的辅助诊断依据，应用ICSI技术能解决部分遗传相关男性不育患者的体外受精问题，合理应用PGD技术进行移植前胚胎选择，能避免遗传缺陷的传代，具有重要临床意义。

不育; 男性; 染色体畸变; 多态现象, 遗传; 核型分析

Key woorrddssinfertility; male; chromosome aberrations; polymorphism,genetic; karyotyping

夫妇不采用任何避孕措施规律夫妻生活1年以上、由于男方因素造成女方不孕者称为男性不育，大约有30%的男性不育患者表现为严重少、弱精子症或无精子症[1,2]。非梗阻性无精子症和严重少精子症的病因尚不清楚，其中约有30%的患者是由于染色体畸变或基因突变等遗传学因素引起的[3-5]。

辅助生殖技术的发展让许多严重少精子症、无精子症患者拥有了自己的下一代。虽然体外受精/单精子胞浆内显微注射-胚胎移植（IVF/ICSI-ET）革命性地改变了不孕症的治疗，与之相伴随，潜在的遗传风险对子代的影响也相应提高，同时，仍然有众多患者反复移植优质胚胎，但却没有获得良好的妊娠结局，研究表明可能与染色体异常相关[6]，因此，胚胎移植前筛查相应的遗传学缺陷，对于节省医疗费用，有效配置医疗资源，制定下一步诊疗策略都非常重要。另外，目前的胚胎移植前遗传学诊断技术（PGD）并不能完全筛查所有的遗传疾病。因此，有必要深入总结和评估男性不育症特别是重度少、弱精子症以及特发性无精子症患者的细胞遗传学特点，为指导临床治疗提供支撑及依据。

本研究通过回顾性分析男性不育患者的外周血染色体核型检查结果及各种染色体异常的检出率，总结男性不育遗传缺陷的规律并分析其临床意义。

对象与方法

一、研究对象

回顾性分析2007年1 月至2013 年6月北京大学第一医院妇产科遗传研究室男性不育患者的外周血染色体核型分析结果，其中包括少精子症、弱精子症、严重少及弱精子症或无精子症及其他不明原因不育症患者。根据WHO第四版的精液检验的相关诊疗指南，严重少精子症是指：精子计数小于5×106/ml；严重弱精子症是指：前向运动精子的比率低于10%，无精子症定义为至少两次精液高速离心沉渣镜检结果显示无精子。总共有813例不育症患者纳入本次研究。所有检测者均在专科门诊就诊，均进行了体格检查、专科体检和至少两次精液分析。排除内分泌、免疫、感染和生殖器异常等因素，经专科医师诊断具备进行细胞遗传学核型分析的指征，常规抽取外周血，进行染色体核型分析。

二、细胞遗传学分析

常规外周血淋巴细胞培养68～72h，收获前加秋水仙素作用于细胞3～4h后常规方法制片。标准技术Trysin-Giemsa染色，G显带。计数培养的30个细胞中期分裂相, 分析5个核型；染色体异常者分析10个核型。根据人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）对所检染色体进行命名。人类染色体的多态性表现在结构异染色质的数量和位置的改变。有高度重复顺序的DNA 区域，为异染色质区, 分别位于人类染色体的1、9、16号染色体、Y染色体的异染色质区和着丝粒区，至少有2名遗传学家对染色体异常的结果进行分析、认定及复核。

结 果

一、男性不育患者染色体核型异常分析结果

在813例患者中，检出染色体异常55例，检出率为6.76 %。其中，染色体数目异常36例，检出率为4.43%，占总异常数目的65.4%；染色体结构异常17例，检出率为2.09%，占总异常数目的30.91%；假两性畸形2例（核型为46, XX，社会性别为男性）。其中，最常见的染色体数目异常为46, XXY，即克氏征（非嵌合型）；最常见的结构异常为染色体相互易位14例，其中罗氏易位5例，涉及13、14、15、22及22号等染色体。导致男性不育临床效应的直接表现分别为少、弱、畸形精子症以及无精子症等，见表1。

表1 男性不育中染色体核型异常分析结果

二、男性不育患者染色体多态性的核型分析结果

在813例患者中，共发现 44例染色体多态性，检出率为5.41%。其中，常染色体多态性11例，检出率为1.35%，占总多态性数目的25%（11/44），表现为随体变异及次缢痕增长，核型分别是：46, XY, 21pstk+（2例）；46, XY, 15ps+（2例）；46，XY, 15pstk+（1例）；46, XY, 1qh+（2例）；46, XY, 11qh+（1例）；46, XY, 16ph+（1例）；46, XY, 16qh+（2例）。 Y染色体的多态性包括大Y核型21例，检出率为2.58%，占多态性总数目的44.73%（21/44）；小Y核型12例，检出率为1.48%，占多态性总数目的27.27%（12/44）。最常见的多态性变异为Y染色体的变异，其次是常染色体的多态性。染色体多态性导致男性不育临床效应的直接表现为少、弱精症及无精症等，见表2。

表2 男性不育中染色体多态性的核型分析结果

讨 论

本文通过回顾性临床研究，探讨了男性不育患者中染色体核型异常的检出率，并进行了分析，为总结男性不育症的细胞遗传学规律，指导辅助生育技术的选择提供了借鉴。在大约50%的不孕不育夫妇中，男性因素是主要或者协同因素，广义的男性生殖功能障碍包括不孕与不育两个层面。第一层面是指男方原因导致女方未能受孕；第二个层面是指对夫妻虽然能够妊娠，但不能正常维持整个妊娠过程并分娩健康活婴，导致不良孕产结局[1,2]。本文中的男性不育症指的是规律夫妻生活至少1年但未能使女方受孕者，不包括配偶具有不良妊娠史的病例。

本研究结果发现，克氏征（Klinefelter综合征）仍是导致男性不育症的最常见的染色体核型异常（研究结果中表1）。对813例男性不育患者进行染色体核型分析发现共有36例染色体数目异常，其中，33例为Klinefelter综合征（非嵌合型），核型为47, XXY，临床效应为男性不育，患者的临床表现为小睾丸及无精子症。睾丸活检病理学显示大部分生精小管萎缩硬化或透明化，部分生精小管仅剩支持细胞，睾丸间质细胞数目减少。提示重度的睾丸生精功能障碍[7-10]。发病机制是由于多余的X染色体在减数分裂时不分离所致，多余的X染色体的剂量效应导致了该类核型患者睾丸小而质硬，睾酮合成功能低下，发生严重少精子或无精子症[8]。随着男科及生殖医学的进展，应用睾丸显微外科取精手术联合辅助生殖技术，使得本类患者有希望成为遗传学意义上的父亲[8,9]。国内亦有显微睾丸取精术成功案例的报道[10]。ICSI技术、PGD技术与睾丸显微外科技术的交叉与互补，使得克氏征患者实现作为遗传学意义上父亲的梦想成为可能。

本研究发现男性不育中染色体结构异常还包括染色体相互易位。在本组中，检出相互易位14例；其中罗氏易位5例，涉及13、14、15 及22号染色体。染色体相互易位导致男性不育临床效应的直接表现为弱精子症，少精子症及无精子症等。相互易位是指两条染色体同时各发生一处断裂和变位重接而形成的两条结构上重排的染色体，相互易位如无遗传物质的丢失为平衡易位。平衡易位由于没有遗传物质的丢失，保留原有基因的总数，只发生了基因在染色体上相对位置的变化，因此本人表型正常，但可以遗传[11,12]。 研究发现男性染色体平衡易位携带者，精子发生的第一次减数分裂中期的二倍体中交叉图像减少，交叉与联会有关，并影响二倍体的形成，使减数分裂受阻，导致精子生成减少、异常及男性不育。罗氏易位是指两个具有近端着丝粒的染色体（13，14，15，21，22号染色体）于着丝点附近断裂，着丝点融合，两条染色体长臂重接成为易位染色体，由于丢失的两条短臂上所含基因甚少，罗氏易位携带者通常表型、智力正常，但是在精子减少分裂中会出现染色体分离不均衡现象，因此，男性罗氏易位常常伴有少、弱精症导致男性不育以及配偶的不良妊娠事件[13,14]。目前，ICSI技术可以解决男性罗氏易位少、弱精子症的受精问题[14]，对于受精后胚胎核型异常引起的流产、畸形儿等不良妊娠结局，应用PGD技术，利用荧光原位杂交FISH（fluorescence in situ hybridization）对体外受精形成的胚胎进行检测，选择染色体平衡的胚胎进行移植，不仅能解决男性罗氏易位患者的生育问题，同时，还可以避免因反复流产、胚胎停育、出生畸形儿等带来的精神及身体上的痛苦和伤害[14]。

本研究还发现男性不育中染色体结构异常还包括倒位，共检出3例，占染色体异常总数目的5.45%，涉及9号及11号染色体。染色体倒位是指染色体发生两次断裂后，两断点之间的片段旋转后重接，造成染色体上基因顺序的重排。倒位发生在长臂和短臂之间称臂间倒位。其中inv(9)在人群中发生率较高[15,16]，inv(9)是一种多态现象，还是属于结构异常, 目前观点不一致[16]。倒位由于本身没有遗传物质的丢失，携带者本身多无症状，但由于染色体结构异常，减数分裂开始时倒位的染色体和同源的正常染色体之间的配对发生困难，从而影响精子发生过程，使精子发生过程阻滞在精母细胞阶段，而不能分化成正常精子，而使患者表现为无精子症或少、弱精子症导致男性不育以及配偶的不良妊娠结局[15]。对于染色体倒位患者的治疗，ICSI技术能解决男性倒位携带者少、弱精子症的受精问题，对于反复胚胎停育、自然流产等，需要借助PGD技术进行胚胎的筛选。

本研究结果提示：染色体多态性现象在男性不育症中常见，尤其是Y染色体的长度变异更值得关注。本研究结果共检出染色体多态性44例，检出率为5.41%。其中，常染色体多态性11例，检出率为1.35%，占总多态性数目的25%（11/44），表现为随体变异及次缢痕增长（见表2）。男性不育临床效应的直接表现包括少、弱精子症及无精子症等。染色体多态性以往多认为无临床效应，但当前的观点认为多态性与男性不育及不良妊娠事件关系密切[17]，我们的研究结果也支持这一观点。本研究结果显示次缢痕增长多态性涉及1、11、16号染色体（见表2）。这与其他的研究报道一致。由于1、9、16号染色体次缢痕异染色质区是易发生自发和诱发断裂的部位, 它的增加或减少可能使得纺锤丝微管不能与染色体正常连接, 干扰染色体的正常运动和分离, 致染色体数目异常, 产生非整倍体, 而引起一系列临床效应[17]。本研究发现染色体随体变异多态性共5例，涉及15，21号染色体，即D/G组染色体，核型分别是：46, XY, 21pstk+（2例）；46, XY, 15ps+（2例）；46, XY, 15pstk+（1例），D/G组染色体的着丝粒与其随体区相邻，随体变异可能增加端着丝粒染色体的不分离，从而导致精子发生染色体非整倍性变异或使得减数分裂中异常配子产生的可能性增加，产生男性不育的临床效应。

Y染色体变异对于男性不育的影响目前观点并不一致[18-23]，但我们的结果提示Y染色体长度变异具备一定的临床效应，导致少、弱精子症及无精子症等。本组共检出大Y及小Y染色体变异共33例，检出率为4.06%。Y染色体的多态性包括大Y核型21例，检出率为2.58%，占多态性总数目的44.73%（21/44）；小Y核型12例，检出率为1.48%，占多态性总数目的27.27%（12/44），本研究结果与其他研究结果相一致[18-23]。Y染色体的多态性临床效应为无精子症及少、弱精子症，可能是由于Y染色体长臂异染色质区域延长，可使该区特有的串联重复序列过多重复，在精子生成过程中，影响生精细胞的减数分裂，不能形成成熟的精子，从而发生无精子症和少、弱精子症[19-22]。对于小Y核型，与男性不育的关联更为密切，这是因为Y染色体长臂（Yq11）常染色质区存在精子发生相关基因，称为无精子因子（azoospermia factor, AZF），AZF的缺失会导致无精子症或弱精子症等临床效应[23-25]。因此，Y 染色体的长度变异不能仅仅被认为是一种多态性，而可能是导致男性不育的重要因素之一，具体机制值得深入研究。另外，也不能仅仅将Y染色体长度变异作为一种核型来研究，应该再进行分类[18]，后续研究需要在分子生物学层面对其调控机制进行详细阐述。

综上所述， 染色体异常及多态性变异与精子发生及其质量关联密切，染色体数目结构异常、多态性变异均是导致男性生育力低下的重要因素，主要包括性染色体数目异常（非嵌合克氏征）、Y染色体多态性（大Y及小Y变异）、染色体倒位及平衡易位等。在男性不育症的临床诊疗中，染色体核型分析是重要的辅助诊断依据，应用ICSI技术能解决部分遗传相关男性不育患者少、弱精子及无精子症导致的体外受精难题，而谨慎并合理地应用PGD技术对正常胚胎进行选择，则能避免遗传缺陷的传代，具体值得深入研究。

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（2013-10-15收稿）

The clinical significance analysis of the cytogentic abnormality in the infertile males＊

Chen Liang, Fu Jie, Yu Li, Qi Wen, Ma Jingmei, Pan Hong, Chen Fei, Zhang Na, Wang Sheng, Ju Huiyan, Xue Qing, Zuo Wenli, XuYang, Yang Huixia
Medical Center of Reproductive and Genetics, Peking University fi rst Hospital, Beijing 100034, China

ObjectiveeTo investigate the clinical signifi cance of the cytogenetic abnormality in the infertile males.MetthhooddssCytogenetics of patients was examined by culturing peripheral-blood lymphocyte and G-banding technology, and karyotyping analysis technique were used to study the abnormality and the polymorphism of chromosomes.ResultssOf 813 infertile men, 55 (6.76 %) were detected to have chromosomal abnormalities in chromosomal analysis, including 36 cases with the numeric abnormality (4.43%), 17 cases with chrom osomal rearrangement (2.09%). In 55 cases with chromosomal abnormalities, the constituted ratios of numeric aberration and the rearrangement were 65.4% and 30.91% respectively. Two cases of male pseudohermaphroditism were detected. Klinefelter syndrome and balanced reciprocal translocations were the most common aberration of the chromosomal abnormalities. In addition, 44 cases were detected to have polymorphicvariations (5.41%,44/813), including 11 cases with the somatic chromosomal polymorphic variations (1.35%,11/813), 21 cases with the big Y(2.58%,21/813) and 12 cases with bit Y chromosomal(1.48%,12/813). The somatic chromosomal polymorphism included secondary constriction increases, satellite increases in the D/G group. Y chromosomal polymorphism was the most common chromosomal polymorphism. The main clinical features of the male infertility attributing to the chromosomal abnormality and polymorphism were azoospermia, abnormal spermatozoa (oligozoospermia, asthenospermia and teratozoospermia).ConcluussiioonnChromosome and abnormality polymorphisms showed negative effects on the male fertile function. The infertile males with chromosomal abnormality or polymorphisms defi nitely had an increasing risk in heredity. Karyotype testing screening is necessary for the infertile males, and PGD is helpful to decrease the genetic risk.

R 698.2; R 394.22

资助∶ 北京市自然科学基金资助项目（编号∶ 7142158）

ddooii∶10.3969/j.issn.1008-0848.2014.02.004