水产养殖益生菌CW9的鉴定及发酵条件优化＊

夏振强，朱 明

（1.中国矿业大学 环测学院，江苏 徐州 222116；2.淮海工学院 江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005）

药物残留问题一直困扰着水产养殖业的发展。从长远来看，必须改变传统的养殖和病害防治模式。筛选益生菌制成微生物制剂来取代抗生素等抗菌类化学药品，能够避免抗生素所带来的幼苗免疫力下降、药物残留、二次污染等负面影响，实现清洁和环境友好的水产养殖模式，被联合国粮农组织确定为水产养殖业疾病控制的主要研究领域之一［1］。目前已有一些微生物活性制剂应用于鱼、虾、蟹、软体动物的养殖和饵料生物的培养，显示出良好的经济效益［2－3］。常见的水产养殖益生菌包括各种光合细菌、硝化菌、反硝化菌、乳酸细菌、弧菌属、芽孢杆菌属及假单胞菌属等微生物［4－5］。

本课题组从连云港对虾养殖水体分离到一株细菌CW9，养殖实验证明，该菌的投放能够有效提高南美白对虾和中华绒螯蟹虾蚤状一期幼体的变态率和存活率［6］。本文通过16SrDNA序列同源性分析和生理生化反应对该菌进行了鉴定，并以生物量为考察因素，对菌株N6的发酵培养基组成和发酵条件进行了优化，为该菌株的规模化应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

益生菌CW9，由笔者所在课题组筛选及保存。

1.2 培养基

斜面培养基：蛋白胨5g／L，酵母膏1g／L，NaCl 20g／L，琼脂18g／L，pH 7.0。

种子培养基：蛋白胨5g／L，酵母膏1g／L，NaCl 20g／L，pH 7.0。

出发培养基：葡萄糖6g／L，硫酸铵4g／L，酵母膏1g／L，NaCl 20g／L，pH 7.0。

以上培养基121℃，灭菌20min。

1.3 种子培养

取新鲜菌种1环，接入装有60mL新鲜种子培养基的250mL三角瓶中，于28℃、180r／min培养箱中振荡培养24h。

1.4 初始发酵培养条件

根据实验需要配制发酵培养基置于500mL三角瓶中，装液量为100mL，接入上述新鲜种子液1 mL，于28℃、180r／min培养箱中振荡培养24h。

1.5 菌种鉴定

16SrDNA的测定由上海生物工程有限公司完成；生理生化反应管购自杭州天和微生物有限公司。

1.6 细胞浓度与吸光度关系曲线

取10mL新鲜菌液在5 000r／min离心10min，倒去上清液，沉淀菌体用生理盐水溶液重新悬浮，还原体积，再将此菌悬液分别稀释4，6，8，10，12，14倍，在波长630nm测定OD值，生理盐水作为参比，重复3次。同时平板稀释涂布法计数测定原菌液的细胞浓度，绘制细胞浓度与吸光度关系曲线，得细胞浓度C＝（3.610 6×OD630－0.307 4）×109（cfu／mL），r＝0.997 6。此后实验过程中的细胞浓度通过测定OD630，再依据此公式换算得出。

2 结果与分析

2.1 益生菌的鉴定

2.1.1 形态特征 该菌株为革兰氏阳性菌，无芽孢，无荚膜，不运动；在平板上菌落黄色，圆形，中间突起，光滑，湿润；静止期细胞多数呈球形，φ（0.5～1）μm，少量呈短杆状，φ（0.2～0.4）μm×（1.4～2.0）μm；旺盛生长期全部呈杆状，端圆，常呈“V”字形排列；球状菌时期革兰氏阳性，杆状菌时期革兰氏弱阳性甚至阴性。

2.1.2 生理生化反应 CW9菌的生理生化反应结果如表1所示。

表1 CW9菌生理生化反应结果Table 1 Physiological and biochemical characteristic analysis of CW9

图1 基于16SrDNA序列的进化树分析Fig.1 Phylogenetic trees inferred from 16SrDNA sequence using neighbor－joining method

进化树分析表明：益生菌CW9与Arthrobactersp.TCCC23001的亲缘关系最近，但两者的相似性也只有96%。经对比《伯杰氏细菌手册》，该菌与手册描述的菌落形态及显微特征一致，生理生化反应特征基本一致。因此，可以确定CW9为一株节杆菌，故将其命名为Arthrobactersp.CW9。但该菌属于哪个种还待进一步确认。

2.2 发酵条件优化

2.2.1A.sp.CW9的生长曲线 配制出发培养基，分装12个500mL三角瓶，每瓶100mL，28℃、摇床180r／min培养，定时取样，波长630nm测定OD值，根据公式换算成细胞浓度。结果如图2所示。综合考虑效率与产量两个因素，确定在培养到21h结束发酵，此时细胞浓度为5.47×109cfu／mL。

2.2.2 温度对A.sp.CW9生长的影响 其他条件不变，改变培养温度，摇床保温21h后，考察A.sp.CW9的生长情况，在波长630nm测定OD值，根据公式换算成细胞浓度，结果如图3所示。从图中可以看出，26℃时A.sp.CW9长得最好，温度超过30℃则生长率急剧下降。

图2 A.sp.CW9生长时间曲线Fig.2 Growth curve of A.sp.CW9

2.2.3 初始pH对A.sp.CW9生长的影响 其他条件不变，改变培养基的初始pH，摇床培养21h后，测定菌体生长情况。如图4所示，有利于A.sp.CW9生长的培养基初始pH为7.5。

图3 温度对A.sp.CW9生长的影响Fig.3 Effect of temperature on the growth of A.sp.CW9

图4 pH对A.sp.CW9生长的影响Fig.4 Effect of pH on the growth of A.sp.CW9

2.2.4 接种量对A.sp.CW9生长的影响 保持出发培养基不变，初始pH调为7.5，改变接种量，摇床培养21h后，测定菌体生长情况。图5数据显示，在实验范围内，接种量对最终细胞浓度影响不是太大，其中2%的接种量相对较好。

图5 接种量对A.sp.CW9生长的影响Fig.5 Effect of inoculation volume on the growth of A.sp.CW9

2.2.5 摇床转速对A.sp.CW9生长的影响 其他条件不变，接种量为2%，改变转速分别为160，180，200以及220r／min，摇床培养21h后，测定菌体生长情况。图6显示，摇床转速200r／min最有利于A.sp.CW9的生长。

2.2.6 碳源种类及其质量浓度的优化 其他条件不变，改变碳源种类，质量浓度都为6g／L。摇床培养21h后，测定菌体生长情况。结果显示，葡萄糖的利用效果最好，效果显著优于其他（图7）。进一步的质量浓度优化实验表明，8g／L的葡萄糖质量浓度有利于A.sp.CW9的生长（图8）。

图6 摇床转速对A.sp.CW9生长的影响Fig.6 Effect of rotation speed on the growth of A.sp.CW9

图7 不同碳源对A.sp.CW9生长的影响Fig.7 Effects of carbon sources on the growth of A.sp.CW9

图8 葡萄糖质量浓度对A.sp.CW9生长的影响Fig.8 Effect of glucose concentration on the growth of A.sp.CW9

2.2.7 氮源种类及其质量浓度的优化 其他条件不变，改变氮源种类，质量浓度都为4g／L。摇床培养21h后，测定菌体生长情况。结果显示，有机氮源中的牛肉膏和蛋白胨作为氮源，A.sp.CW9的生长效果最好，远优于无机氮源。豆饼粉作为无机氮源的效果不好，可能与其难以利用有关（图9）。进一步的质量浓度优化实验表明，5g／L的蛋白胨质量浓度为最佳（图10）。

图9 不同氮源对A.sp.CW9生长的影响Fig.9 Effects of nitrogen sources on the growth of A.sp.CW9

图10 蛋白胨质量浓度对A.sp.CW9生长的影响Fig.10 Effect of peptone concentration on the growth of A.sp.CW9

2.2.8 酵母膏质量浓度的优化 在发酵培养基中，酵母膏不仅作为氮源，而且是重要的生长因子提供者。优化实验结果如图11所示，酵母膏的最佳质量浓度为3g／L。

图11 酵母膏质量浓度对A.sp.CW9生长的影响Fig.11 Effect of yeast extract concentration on the growth of A.sp.CW9

2.2.9 NaCl质量浓度的优化 如图12所示，NaCl质量浓度为10g／L时，A.sp.CW9的生长情况最好，细胞浓度达6.90×1010cfu／mL。随着NaCl质量浓度的升高，最终的细胞浓度缓慢降低，说明该菌对NaCl质量浓度有较强的耐受性。

图12 NaCl质量浓度对A.sp.CW9生长的影响Fig.12 Effect of NaCl concentration on the growth of A.sp.CW9

3 结论

经过菌落形态特征、生理生化反应分析以及16SrDNA的鉴定，确定益生菌CW9是节杆菌属的一个种，命名为Arthrobactersp.CW9。进化树分析未发现与该菌遗传特征特别相近的菌种，是否新种有待深入研究。发酵条件及培养基优化结果为：葡萄糖8g／L，蛋白胨5g／L，酵母膏3g／L，NaCl 10 g／L，pH 7.5，温度26℃，接种量为2%以及摇床转速为200r／min，培养21h后，获得最大的细胞浓度达6.90×1010cfu／mL。与出发条件相比，细胞浓度提升显著，为该菌株的工业化应用奠定了基础。

［1］ SUBSNGHE R.FAO Fisheries Circular No.886［R］.Rome：Food and Agriculture Organization of the United Nations，1997：45－49.

［2］ 刘忠颖，刘洋，鲍相渤，等.水产养殖益生菌的研究进展［J］.水产科学，2010，28（8）：500－504.

［3］ 楼丹，杨季芳，谢和.益生菌在水产养殖中的作用［J］.浙江万里学院学报，2009，22（2）：78－83.

［4］ 刘君，宋晓玲，陈志鑫.益生菌对水产动物的作用研究进展［J］.动物医学进展，2009，30（9）：78－81.

［5］ 周国勤，陈树桥，茆建强，等.益生菌在水产养殖方面的研究 进 展 ［J］.安 徽 农 业 科 学，2006，34（11）：2421－2425.

［6］ 朱明，莫照兰，阎斌伦，等.节杆菌CW9及其用途：CN，201010572426.6［P］.2013－08－28.