禽流感现状调查及监测方法对比试验

赵青松李德军( 湖北三峡职业技术学院生物化工学院 湖北宜昌443000 湖北襄阳市军事经济学院襄阳士官学校基层军需系 湖北襄阳448)

2009年我市曾确诊1例高致病性禽流感，给我市家禽养殖造成了较大损失。时隔数年，我市家禽养殖再次得到长足发展，2013年出笼家禽3585.25万只，规模化养殖比例达到74%，高致病性禽流感也得到了有效控制，但加强禽流感的监测和预防仍对我市家禽养殖的健康发展具有重要意义。为此，近期笔者再次对我市家禽养殖和交易市场的现状进行调查，以期了解流行现状，并针对性与酶联免疫吸附试验（ELISA）进行对比试验，以期找到快速监测禽流感的有效措施。

1 材料与方法

1.1 病料的采集

1.1.1 疑似病例病料样品的采集

通过调查走访，对于出现咳嗽、喷嚏，甩头，产蛋量下降，畸形蛋增多，或者死亡率增加的禽群进行气管咽部采样，共采样55份，其中肉仔鸡病料样品30份，地方土鸡病料样品25份。

1.1.2 阳性禽群血清样品的采集

对经ELISA检测呈阳性的肉用仔鸡群于40日龄时采集血清样本，共采集血清样品20份。从某鹌鹑场采集鹌鹑血清样品18份。

1.1.3 交易市场随机样品的采集

分批随机采集进市交易的鸡、鸭血清样本，共80份。

1.2 采样方法

1.2.1 气管咽部样品

用手将喙拨开，用手或镊子将舌头拉出，露出咽部，将棉拭子插入咽部气管内，搅动几下（尽可能多地蘸取咽部黏液），取出棉拭子放入样品管内（事先已加试剂盒提供的“7号液”250μL），用力搅拌、挤压，尽可能使棉拭子上的样品洗脱下来，弃去棉拭子，管内的液体即为待检样品。

1.2.2 血清样品

用针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至6～8cm长，将管一端烧融封口，待凝固析出血清后以1000r/min，离心5min，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中。若需要保存一段时间，可在离心后将凝血一端剪去，滴融化石蜡封口，于0℃保存。

1.3 药品、仪器与试剂

1.3.1 试剂盒

夹心ELISA检测禽流感病毒抗原诊断试剂盒，由华中农业大学动物医学院微生物学研究室提供。

1.3.2 抗原禽流感H5、H7和H9抗原，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。HA效价在1：64以上。

1.3.3 血清

禽流感H5、H7和H9阳性血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。

2 结果与分析

2.1 夹心ELISA检测禽流感病毒抗原诊断试剂盒检测结果

共采集样品55份，用夹心ELISA检测禽流感病毒抗原诊断试剂盒检测，结果肉用仔鸡30份，样品中有26例呈阳性，比例为26/30；地方土鸡25份样品全部为阴性（见表1）。

2.2 琼脂扩散试验结果

分别于肉仔鸡场、鹌鹑场和交易市场采集样品，其中经夹心ELISA检测禽流感病毒抗原诊断试剂盒检测呈阳性的肉仔鸡场的血清样品20份，有明显沉淀线的有18份，阳性比率为18/20。鹌鹑场血清18份，有明显沉淀线的有18份，阳性比率为18/18。交易市场随机采样80份，其中土鸡10份，肉鸡35份，蛋鸡10份，鸭15份，阳性比率为2/35（见表2）。

表1 夹心ELISA检测禽流感病毒抗原诊断试剂盒检测结果

表2 琼脂扩散试验结果统计

2.3 HA和HI试验结果

采集经夹心ELISA检测禽流感病毒抗原诊断试剂盒检测呈阳性的肉仔鸡场的血清样品20份，进行HA和HI试验，检测结果表明，H7抗原的HI价均超过24，阳性率为20/20。H5抗原的HI价有15份达到或超过24，阳性率为15/20。H9抗原孔全部出现凝集现象，说明鸡的血清不含H9亚型的抗体。

2.4 结果分析

（1）检测结果表明，我市仍面临着H5和H72种强毒株禽流感的威胁，应给予高度重视。

（2）阳性禽群主要来自冬春季节的肉仔鸡养殖场，其临床表现为10日龄左右出现严重的呼吸道症状，咳嗽、喷嚏或甩头，但群体精神状态良好，采食、饮水和死亡率基本正常，使用抗生素治疗无效或不理想。发病早期使用抗病毒药物症状有明显减轻，停药则复发，20～25日龄时呼吸症状减轻或消失。因此，发现类似症状的鸡群时，要及时进行监测，防止禽流感病毒扩散。

（3）本次试验3种方法的检测结果基本吻合，而夹心ELISA检测禽流感病毒抗原诊断试剂盒检测法检测速度最快，检测过程简单，操作容易，检测准确性高，是进行禽流感快速检测的有效方法，可予以推广使用该方法。

（4）来自集贸市场的阳性血清说明畜禽的频繁流通是禽流感传播的重要途径。鹌鹑场的发病可能是该场从外地引种所致，也可能是进市场送鲜蛋而带毒感染。

（5）历史上高致病性禽流感都是由H7及H5亚型成员引起，但并非H5和H7都是强毒。本次调查中肉鸡场的毒株虽然为H7及H5亚型，但鸡群发病后只在临床上表现出明显的呼吸道症状，而采食、饮水、粪便和死淘率基本正常。

（6）针对本次检测结果，我市禽流感的免疫预防可以选择H5亚型流行株同分支的疫苗进行免疫。免疫程序可设计为：肉鸡5～7天，0.3mL皮下注射，保护整个生长期。种鸡和蛋鸡7～10天，0.3～0.5mL皮下注射；18～20天加强免疫，0.5mL胸肌注射；50～60天再接种1次，0.5mL胸肌注射；经3～6个月再免疫1次。