鸡内脏型马立克氏病的诊断

宋军 汪文浩 单雪芹 夏新成

（广东温氏食品集团股份有限公司 广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室广东新兴 527439）

合肥市本地某养殖场鸡群发生以鸡只精神沉郁、机体渐渐消瘦、鸡只站立不稳及剖检以内脏型肿瘤症状为主要特征的疾病，综合采用临床剖检观察病变、病理学和分子生物学检验等诊断技术，诊断为马立克氏病感染。现将诊断过程报道如下。

马立克氏病是由马立克氏病病毒引起的重要的传染性肿瘤病[1]，以淋巴细胞增生和肿瘤形成为特征，外周神经、各种脏器、肌肉、虹膜和皮肤等发生单核细胞浸润，进而引起许多功能障碍。马立克氏病可以导致肿瘤发生，感染鸡群生产性能下降，免疫应答水平降低，容易继发感染其他疾病，死亡率升高，给家禽养殖业带来巨大经济损失。2013年11月，安徽省合肥市某养殖户110日龄左右土鸡开始出现消瘦、瘫腿等情况，每天出现零星死亡。该养殖场已按正常免疫程序进行了马立克氏病、禽流感、新城疫和传染性支气管炎等疫苗免疫。笔者对病死鸡进行临床剖检观察，初步诊断为内脏型肿瘤病，之后通过病理学变化和分子生物学的检测，对该病诊断为马立克氏病并提出相应的处理措施。

1 材料与方法

1.1 样品来源

取发病鸡只的心脏、肝脏等组织中眼观明显有肿瘤的部位，并置于4%中性甲醛溶液中固定。

1.2 试剂、器材及仪器

4%中性甲醛、无水乙醇、二甲苯、苏木精染液、冰醋酸等；PrimeScriptOneStepRT-PCRKitVer.2试剂盒、MarkerDL2000等；染色缸、载玻片和盖玻片等；冷冻切片机、电热恒温鼓风干燥箱和光学显微镜等。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中登录的MDV (AF147806)和MDV(JX844666.1)的基因序列，设计并合成引物用于检测MDV。引物由上海生工公司合成。

MDV-F：5’-TACTTCCTATATAGATTGAGACGT-3’；MDV-R：5’-GAGATCCTCGTAAGGTGTAATTA-3’；目的条带约为434bp。

1.4病理学观察

对发病鸡只进行记录，对病死鸡只进行临床剖检，记录临床症状。取心脏和肝脏发生明显肿瘤组织于4%中性甲醛中固定，使用冷冻切片，HE染色，光学显微镜观察。

1.5 PCR诊断

1.5.1 病毒RNA的提取

取病死鸡肝组织和脾脏，研磨，反复冻融破碎，使用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒抽提组织中病毒DNA，-20℃保存备用。

1.5.2 PCR反应

采取50μLPCR反应体系。

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PCR反应条件如下：50℃30min，95℃3min；95℃30s，50℃40s，72℃40s，进行35个循环；最后延伸10min。PCR产物进行凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 临床症状及剖检观察

发病鸡群整体消瘦，精神沉郁，鸡冠和肉髯发育不良、苍白或萎缩；部分病鸡缩头呆立，羽毛蓬松。病程较长的鸡消瘦，生长停滞，最终衰竭而亡。

剖检发现气囊都清亮，心脏和肝脏上有凸出于表面质地坚实的灰白色结节，肝脾肿大，肝脏表面有凸出的黄豆粒大小的灰白色结节，见图1a和图1b。其余症状不明显。

2.2 病例组织学观察

所取病料的病理学检查结果见图2。由图2a可知，在心肌纤维间有淋巴样瘤细胞浸润；图2b中的肝组织中出现肿瘤病灶，正常结构已经被破坏，其中可见大小不等的淋巴瘤细胞浸润，且瘤细胞多见核分裂相。

观察本病例发现在心脏和肝脏中均有肿瘤病灶发生，显微镜下可见肿瘤细胞为多形态淋巴样细胞，可据此区别于淋巴细胞样白血病和网状内皮组织增生症。

2.3 分子生物学诊断

以肝脏、脾脏组织抽提的DNA为模板，进行MDV的PCR扩增，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果在500bp稍下处有一条亮带，见图3，与预期大小（434bp）相符合。

图1a 肝脏肿瘤

图1b 心脏肿瘤

图2a 心脏肿瘤组织切片

图2b 肝脏肿瘤组织切片

3 讨论

近年来，鸡的肿瘤性疾病，如鸡马立克氏病、淋巴细胞白血病和网状内皮增生病均可引起肿瘤的发生，在疾病诊断过程中需要注意三者的鉴别诊断[2]。禽白血病肿瘤细胞以形态一致的成淋巴瘤细胞为主；网状内皮组织增生病中的网状细胞样瘤细胞弥漫性或结节性增生；马立克氏病的肿瘤细胞在组织学上有其特有形态，即大小不等、着色不均及多见核分裂项的淋巴样瘤细胞。

本实验通过病例组织学及病原学的检测方法，对该养殖场的发病鸡进行检测，在临床剖检时发现内脏型MD的病变特征。病例组织学观察表明肿瘤组织为大小不一、形态多样的淋巴瘤样细胞。PCR检测结果显示，在不同的肿瘤组织中均能检测到MDV，与上述检测结果相吻合，表明该鸡群所患疾病为MD。但此鸡群注射过MD疫苗，却又发生疾病，究竟是因为马立克氏病病毒毒力的不断增强[3]及免疫失败还是存在其他因素导致MD的发生有待进一步的研究。

肿瘤性疾病给养禽业造成了巨大的经济损失，已成为养鸡业健康发展的重要因素[4]。建议当地种鸡养殖业者切实做好MD的疫苗免疫，提高饲养管理水平，并注意日常卫生管理和消毒措施，控制并发或继发感染，同时也需祖代种鸡场做好垂直传播性肿瘤病的检疫净化工作。

[1]Davidson.Invivoeventsofretrovirallongterminal repeatintegrationintoMarck’sdiseasevirusin commercialpoultry:detectionofchimericmoleculesasa marker[J].AvianDis,2001,45:102-121.

[2]GeerligSH，QuanZS，SuurlandB，etal.Efficacyand safetyofcellassociatedvaccinesagainstMarek′s diseasevirusgrowninacontinuouscelllinefrom chickens［J］.Vaccine，2008，26（44）：55-56.

[3]王桂英.鸡马立克氏病的诊断与防治［J］.中国畜禽种业，2010，1：133-134.

[4]曲悦，高立海.尼克珊瑚粉蛋鸡马立克氏病的病理及分子诊断［J］.中国家禽，2010，11（21）：49-50.