发酵条件对产酶的影响

陈文强

（浙江来益生物技术有限公司，浙江 嵊州 312400）

发酵条件对产酶的影响

陈文强

（浙江来益生物技术有限公司，浙江 嵊州 312400）

产凝乳酶活力及C/P（clotting activities/proteolytic activities）值不仅受菌株本身性质的影响，还和发酵条件有关。由于液态发酵的发酵条件可控，在工业化生产凝乳酶方面有较大优势。由于丝状真菌适合在固态培养条件下生长，本章首先将固态发酵培养与液态发酵培养进行对比实验，选择优势较大的液态发酵培养基；然后对液态培养不同孢子培养基、接种量、发酵时间及温度进行优化试验。

发酵；条件；产酶

1 材料与方法

1.1 菌株及培养基

1.1.1 菌株：米黑毛霉（Mucor miehei） MmV-4 0。

1.1.2 培养基

①孢子培养基：沙氏固体培养基（%）：葡萄糖4，蛋白胨1，琼脂2。②种子培养基：同发酵培养基。③豆饼粉培养基：蔗糖5 g/L，豆饼粉50 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaH2PO4·2H2O 3 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L以及NaCl 10 g/L。④GC培养基：葡萄糖30 g/L，玉米浆15 g/L，MgSO4· 7H2O 1.5 g/L，初始pH 5.5[1]。⑤麸皮玉米浆豆饼粉培养基（简称WCS培养基）：10%麸皮水解液50 mL，100 g麸皮在去离子水中加入至沸腾，不断搅拌30 min后，两层纱布过滤残渣后，去离子水定容至1 L，制得10%的鼓皮水解液[2]；其余成分为玉米浆40 g/L、豆饼粉20 g/L，Na2HPO4·12H2O 4 g/L、Na2CO31 g/L以及CaCl21 g/L。⑥蔗糖玉米浆液态培养基（简称SCT培养基）：蔗糖50 g/L、玉米浆40 g/L，胰蛋白胨0.5 g/L，Na2HPO4·12H2O 4 g/L，Na2CO31 g/L以及CaC121 g/L，每250 mL锥形瓶中装液量为50 mL，自然pH；115 ℃火菌30 min后待凉接种[3]。

1.2 试剂

考马斯亮蓝、福林酚以及BSA购买自Sigma公司；脱脂乳奶粉为新西兰进口奶粉；培养基中蔗糖等及无机盐均为生化纯或分析纯。

1.3 生物量的测定方法

将发酵液8000 rpm冷冻离心15 min，排除上清液[4]，沉淀菌体倒入空的培养皿中称量扣除空皿的质量即为生物量，单位为g/50mL。

1.4 液态发酵培养基初步选择

初步选择四种发酵培养基，SCT培养基、麸皮玉米浆、GC培养基及豆饼粉四种液态培养基，固体麸皮培养基作为对照，研究菌株发酵的粗酶液的凝乳酶活力；固体培养基测定样品为培养基的液态提取液，其余四种液态培养基为发酵液的粗酶液；凝乳酶活性的测定方法与Arima等的一致；还测定了C/P值及粗酶液pH的大小。初步选择一种作为后续优化的对象。培养条件为28 ℃，160 rpm，培养96 h。

1.5 孢子培养基对产酶的影响

选择PDA、沙氏培养基和脱脂乳斜面培养基对菌株进行活化培养，培养温度28 ℃，每天观察菌株生长情况，活化时间为斜面表明生成一层黑色（或褐色）孢子，便立即拿出进行发酵试验[5]，发酵温度28 ℃，160 rpm，培养96 h。

培养基的碳氮比会影响微生物的生长和代谢过程[6,7]；对葡萄糖和蛋白胨的碳氮比分别为1∶4、1∶1、2∶1、4∶1和6∶1，在6种培养基的试管斜面上划线活化菌株，转接菌株来自在土豆固体培养斜面上生长的孢子。28 ℃培养2 d后，分别在发酵培养基摇瓶培养3 d，接种量为两环孢子，28 ℃，160 rpm，培养96 h；每组二个平行试验，然后测定粗酶液的凝乳活性及C/P比值。

1.6 不同接种量对产酶的影响

液态种子培养基的接种量一般不超过发酵培养基总体积的10%。本试验选取接种量分别为1%、3%、5%、6%、12%，发酵培养20 h后的种子培养液分别接种到发酵培养基中，发酵温度28 ℃，发酵时间96 h，转速160 rpm，每个平行3次，测定粗酶液的凝乳活性以及C/P的比值。

1.7 发酵时间对产酶的影响

米黑毛霉MmV-4在发酵培养基上培养5 d，温度28 ℃，培养转速160 rpm，接种量2环孢子；每隔24 h对发酵液的凝乳活性、生物量和C/P比值进行测定。

1.8 不同温度对产酶的影响

选择28、30、37 ℃，每组3个平行，研究温度对凝乳酶活性和C/P值的影响。

2 结果与讨论

2.1 液态发酵培养基的初步选择

表1显示：豆饼粉液态培养基粗酶液凝乳酶活性较低，蔗糖胰蛋白胨培养基，固体麸皮培养基和麸皮玉米浆培养基的粗酶液表现较高。蔗糖玉米浆培养基较适合作为生产凝乳酶的液态发酵培养基，比麸皮固体培养基产凝乳酶活力高2倍。最后，确定蔗糖玉米浆培养基为后续实验的发酵培养基。

表1 不同发酵培养基对凝乳酶活力、蛋白酶活力及pH的影响

2.2 孢子培养基种类对产酶的影响

表2显示：不同活化培养基培养MmV-4菌株，产凝乳酶活力及C/P值差异较大，其中用沙氏培养基培养孢子接种到发酵培养基中得到结果最好。

表2 不同活化发酵培养基对凝乳酶活力、C/P的影响

图1显示：活化培养基的碳氮比为4∶1时发酵得到的粗酶液凝乳酶活性最高，碳氮比为1∶4时，发酵得到的粗酶液凝乳酶活性大幅降低。枯草芽袍杆菌产凝乳酶发现，用牛肉膏（3 g/L）和蛋白胨（5 g/L）作活化培养基，种子培养基中添加为豆饼粉（50 g/L），蛋白胨（5 g/L）以及蔗糖（2 g/L），经发酵培养基优化最终获得凝乳酶活力大小为600 SU/mL，蛋白酶活力为0.28。说明发酵前种子培养基中添加适宜碳氮源种类及比例，对提高发酵过程凝乳酶活力和C/P值作用显著。

图1 沙氏培养基碳氮比对凝乳酶活力和C/P值的影响

2.3 不同接种量对产酶的影响

由图2显示：当种子培养基的接种量＞5%时，会明显抑制发酵产凝乳酶活力和C/P值的大小。接种量为3%时的C/P比值较1%高，所以选择3%为最适接种量。

图3 温度对凝乳酶活力及C/P值的影响

2.4 发酵时间对产酶的影响

不同研究者报道不同菌株发酵产凝乳酶的最适发酵时间为1～8 d，米黑毛霉和毛酶J20为4 d，微小毛霉为3 d，橘青霉为8 d，纳豆枯草芽袍杆菌为1 d。

MmV-4菌株合成凝乳酶发酵显示：到发酵48 h后，凝乳酶活力逐渐增长，到84 h发酵液中凝乳酶活力达到最大值为270 SU/mL，同时C/P的比值也最高为60；随后，凝乳酶活力和C/P值出现下降趋势。可以看出，MmV-4菌株合成凝乳酶为滞后合成模式。分析原因，可能凝乳酶生成受抑制物的影响而滞后合成，通过去除抑制物可能延长发酵过程凝乳酶合成时间。

2.5 不同温度对产酶的影响

由图3显示：28 ℃为最适培养温度。

图2 接种量对凝乳酶活力和C/P值的影响

3 小 结

固液态发酵培养米黑毛霉的对比试验发现，蔗糖胰蛋白胨较固态发酵的凝乳酶活性高2倍。液态发酵培养基中主要是碳氮源的种类和比例对发酵液中凝乳活性的影响明显，豆饼粉作为唯一氮源的液态培养基发酵米黑毛霉的发酵液中基本检测不到凝乳酶活性；不同培养基凝乳酶活性大小为蔗糖胰蛋白胨＞鼓皮玉米浆培养基＞豆饼粉蔗糖培养基。

不同活化培养基对菌株发酵产凝乳酶影响较大。当菌株在4%葡萄糖和1%蛋白胨的培养基上活化后，发酵凝乳活性比在PDA培养基上高2倍。

经接种量、发酵时间及温度等发酵条件优化，确定最优接种量为3%，最优发酵时间为84 h，最适温度为28 ℃；凝乳酶活力为优化前的1.5倍，达到60 SU/mL；C/P值为优化前1.32倍，达到280。

[1] 廖亮.凝乳酶高产菌株的诱变选育及其发酵条件、产物酶学活性的相关研究[D].北京:北京化工大学,2010.

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R-03

B

1671-8194（2014）14-0065-03