二甲双胍抑制子宫内膜癌细胞裸鼠移植瘤生长

谢 娅 孙红敏 张 颖 史明星

（郑州大学第一附属医院妇科，河南 郑州 450052）

二甲双胍抑制子宫内膜癌细胞裸鼠移植瘤生长

谢 娅 孙红敏 张 颖 史明星

（郑州大学第一附属医院妇科，河南 郑州 450052）

二甲双胍；子宫内膜癌；癌细胞；裸鼠；移植瘤

子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤，占女性肿瘤患者的6%，且近年来其发病率有上升趋势[1]。大约80%的子宫内膜癌患者诊断为I期并需要行子宫切除术。一些肥胖、糖耐量异常、月经不规则、长期不排卵和多囊卵巢的年轻患者易患子宫内膜癌[2]。这部分患者面临着治疗的困境，非常关心生育功能的保留。因此，保留生育功能的治疗对这些患者来说至关重要。大量证据表明肥胖、糖尿病和胰岛素抵抗是子宫内膜癌的危险因素[3]。

二甲双胍作为治疗2型糖尿病经典而有效的药物，已有近50年的临床应用历史。二甲双胍是一种降血糖药，具有提高血糖耐受性、降低基础和餐后血糖的作用[4]。流行病学研究资料表明合并糖尿病的子宫内膜癌的患者服用二甲双胍可降低子宫内膜癌的死亡风险[5]。

实验室研究也表明二甲双胍有抑制几种肿瘤细胞生长的作用（包括乳腺癌、结肠癌和子宫内膜癌）[6]。我们前期体外研究发现胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）和胰岛素样生长因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）促进细胞增殖，然而二甲双胍抑制子宫内膜癌细胞生长[7]。二甲双胍通常是通过STK11（也称LKB1）激活AMPK[8]，激活过程涉及多个参与细胞增殖调节的信号通路，其中包括mTOR通路[9]。然而，在子宫内膜癌中，65%的LKB1表达缺失，从而导致mTOR信号通路的过度激活[8]。

本研究是在我们前期研究的基础上进一步探讨在动物水平验证二甲双胍是否有抑制子宫内膜癌细胞生长的作用，以期为临床治疗需求新的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 细胞系和试剂

人子宫内膜癌细胞系（HEC-1B）为中分化由北京大学第一医院保存。细胞系维持在DMEM/F12添加10%胎牛血清在37 ℃、5%CO2中。细胞系常规3～5 d传代。二甲双胍购自Sigma公司。用PBS将水溶性药物二甲双胍配制为浓度10-1M的二甲双胍储备液，-20 ℃保存。

1.2 建立裸鼠成瘤模型

实验选用4～6周龄的雌性BALB/c裸鼠10只，北京维通利华实验动物技术有限公司提供（SPF级，实验动物生产许可证号，SCXK（京）2006-0008，体质量为18～24克/只）。饲养由科澳协力饲养有限公司提供的SPF级标准饲料（北京市实验动物质量合格证明编号，SCXK（京）2005-0007）。实验期间所有动物置于同一室内，清洁级饲料饲养，由北京大学医学部科学部持上岗证人员负责饲养，自由进食，饮水。

1.3 实验方案

接种HEC-1B细胞密度5×107/mL，接种前混匀，150 μL细胞/裸鼠，接种于右侧腋下。裸鼠接种人子宫内膜癌细胞HEC-1B细胞株后每天观察其种植部位肿瘤生长情况，进食和活动情况，称重。接种后第7天，把裸鼠随机分成2组：一组给予二甲双胍治疗，另一组为对照。

1.4 给药方案

二甲双胍组：将二甲双胍加入饮用水中，二甲双胍的剂量为250 mg/（kg·d）。对照组：给予相同体积的PBS加于裸鼠的饮用水中。每4 d用游标卡尺测量肿瘤体积，每4 d测裸鼠体质量。每天连续给药30 d后终止试验（终止给药）。在第30天，将裸处死，肿瘤组织剥出，肿瘤组织石蜡包埋，做HE染色。由北京大学医学部分子心血管实验室包埋。在体肿瘤体积的计算：V=π/6（长×宽2）。

1.5 统计学方法

所有的数据都用均数±标准差表示，数据分析用SPSS13.0独立样本t检验，P＜0.05视为有统计学意义。

2 结 果

2.1 肿瘤大小的比较

连续30 d分别给予两组裸鼠饮用二甲双胍250 mg/（kg·d）（二甲双胍组）或等量的饮用水（对照组）。30 d后终止试验，取出肿瘤组织，测量肿瘤的大小：计算肿瘤体积：V=π/6 （长×宽×高），并拍照（图1）。统计两组裸鼠肿瘤体积的差异。每4 d测量裸鼠体质量并测量计算移植瘤的体积，测量重复3次，结果取平均值。结果如图2。

统计结果发现二甲双胍组体内移植瘤体积显著小于对照组（P＜0.05）。

图1 两组裸鼠的肿瘤组织图示

图2 两组裸鼠给药天数与肿瘤体积的变化

2.2 裸鼠体质量的比较

在连续给药的30 d中，每天检测裸鼠体质量，实验重复3次，结果取平均值，结果如图3（图为对照组和二甲双胍组每组裸鼠体质量平均值的变化）所示：可以看出，二甲双胍组裸鼠体质量较正常对照组有下降的趋势，但差别没有统计学意义（P＞0.05）。

图3 裸鼠体质量的比较

2.3 裸鼠体内移植瘤HE染色

如图4所示，将剥出的肿瘤组织做HE染色观察肿瘤组织结构的变化，可以看出，二甲双胍组肿瘤组织中见细胞形态消失，大片坏死细胞，细胞核碎裂。而对照组肿瘤组织中肿瘤细胞核大深染，见多个核分裂相。

3 讨 论

图4 裸鼠体内移植瘤HE染色

我们第一次体内实验验证了二甲双胍有抑制子宫内膜癌细胞生长的作用。持续给予裸鼠二甲双胍能够显著抑制体内子宫内膜癌细胞移植瘤的生长。且在二甲双胍组和对照组的瘤组织HE染色片上我们可以看出，二甲双胍组的瘤组织内出现大片的坏死细胞，核碎裂。而正常对照组瘤组织生长活跃，核大且可见多个和分裂相。根据我们之前的研究结果：①二甲双胍只在高浓度时在诱导子宫内膜癌细胞的凋亡。②二甲双胍能够显著抑制子宫内膜癌细胞增殖。因此我们推测：二甲双胍的作用主要是导致子宫内膜癌细胞的坏死，而不是主要通过诱导其凋亡来抑制子宫内膜癌细胞生长的。

二甲双胍对体质量的影响目前存在争议。我们的结果表明二甲双胍组的裸鼠体质量有减轻的趋势，但差别没有统计学意义。在临床观察发现二甲双胍除了有降糖效应外，还有显著的减轻体质量作用。但其作用机制不明。有研究发现，在前脂肪细胞的培养基中加入二甲双胍后，AMPK磷酸化，抑制细胞内的脂质聚集，从而抑制了脂肪合成。这一机制可能与二甲双胍具有潜在的的减轻体质量重作用有关[11]。

二甲双胍是一种用于治疗2型糖尿病的双胍类降糖药，近来体外实验报道二甲双胍有抑制肿瘤细胞生长的作用，二甲双胍以一种非胰岛素介导的方式直接调节细胞增殖和凋亡。二甲双胍调节的机制是通过激活AMPK，激活的AMPK调节多个信号通路，其中包括mTOR和MAPK信号通路[12]。在我们的体外实验中发现子宫内膜癌移植瘤的裸鼠给予二甲双胍后导致肿瘤细胞坏死增多、核碎裂增多，说明二甲双胍可能导致子宫内膜癌细胞坏死，其机制可能是通过激活AMPK信号通路实现的，关于具体的调节机制是我们下一阶段研究的目标。

二甲双胍治疗2型糖尿病的药物剂量是每天2550 mg。在我们的体内实验中给予裸鼠每天250 mg/kg，相当于成人每天1075 mg/70kg的剂量。因此，在本研究中的剂量不超过二甲双胍人体最大给药浓度，说明二甲双胍能够抑制裸鼠体内人子宫内膜癌细胞移植瘤生长并促进其坏死的结果，对于今后二甲双胍应用于临床治疗子宫内膜癌提供了实验室依据。本研究为临床治疗子宫内膜癌提供了新的思路。

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R737.33；R-33

B

1671-8194（2014）14-0064-02

国家自然科学基金（81202070）资助