人参皂苷免疫纳米对裸鼠人胃癌NUGC-4组织中血管内皮生长因子D表达的影响

戴小军1 王维民2 罗玉妍3 郁梅4 吴永健1

（1.南京中医药大学扬州附属医院、扬州市中医院，江苏扬州 225002；2.宜兴市人民医院，江苏宜兴 214200；3.南京中医药大学，江苏南京 210023；4.扬州大学医学院，江苏扬州 225001）

人参皂苷免疫纳米对裸鼠人胃癌NUGC-4组织中血管内皮生长因子D表达的影响

戴小军1 王维民2 罗玉妍3 郁梅4 吴永健1

（1.南京中医药大学扬州附属医院、扬州市中医院，江苏扬州 225002；2.宜兴市人民医院，江苏宜兴 214200；3.南京中医药大学，江苏南京 210023；4.扬州大学医学院，江苏扬州 225001）

目的：观察人参皂苷免疫纳米（VRIN）对裸鼠人胃癌NUGC-4组织中血管内皮生长因子D（VEGF-D）表达的影响，探讨VRIN防治胃癌淋巴转移的作用机制。方法：24只裸鼠建立NUGC-4人胃癌原位移植模型，并随机分为生理盐水组、5-氟尿嘧啶（5-Fu）组及VRIN组，每组8只，分别给予生理盐水、5-Fu和VRIN干预后，采用免疫组织化学和Real time-PCR方法检测瘤组织VEGF-D蛋白及mRNA的表达。结果：与生理盐水组比较，VRIN对胃癌NUGC-4细胞裸鼠淋巴结转移有明显抑制作用，对肿瘤组织中VEGF-D蛋白和mRNA水平的表达有明显下调作用。结论：VRIN可抑制人胃癌细胞祼鼠移植瘤淋巴结转移，调控淋巴管生长因子VEGF-D蛋白和mRNA的表达是VRIN防治胃癌淋巴转移的可能机制之一。

人参皂苷Rg3 免疫纳米乳 胃肿瘤 血管内皮生长因子D 实验研究

胃癌是主要以淋巴转移为扩散途径的恶性肿瘤，但经历数十年的研究仍未能完全阐明其机理和意义。近年来，随着血管内皮生长因子D（vascular endothelial growth factor-D，VEGF-D）等特异作用于淋巴管内皮的生长因子及受体的发现，抑制胃癌细胞分泌VEGF-D或阻断VEGF-D与受体VEGFR-3结合，成为胃癌转移方面的研究热点，阻断或抑制淋巴转移是提高胃癌疗效的关键[1-2]。本课题组以抗血管内皮生长因子受体3抗体（VEGFR-3 antibody）为介导，制备人参皂苷Rg3肿瘤靶向免疫纳米乳剂（VRIN）。本研究通过建立裸鼠人胃癌NUGC-4原位移植模型，观察VRIN对裸鼠人胃癌模型淋巴结转移率和淋巴管生长因子VEGF-D表达的影响，探讨VRIN在防治胃癌淋巴转移方面的作用机理。

1 实验材料

1.1 动物与瘤株SPF级BALB/c无胸腺裸鼠24只，雄性，6周龄，18～20g，由扬州大学比较医学中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）20120004，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2010-0004。红色荧光蛋白标记人胃癌细胞株NUGC-4-RFP，由美国AntiCancer.Inc公司提供，将含5×106细胞接种于裸鼠皮下，成瘤后，传代成实体瘤。

1.2 主要药物与试剂人参皂苷Rg3肿瘤靶向免疫纳米乳剂（VRIN）：由扬州大学医学院天然药物研究室采用聚乙二醇法制备，VRIN为淡黄色澄清透明液体，TEM观察其乳滴为球形，20℃条件下测定其粘度为（1.09±0.03）mPa·s，电导率为（368.45±0.84）μs/cm，pH值为（7.86±0.12），折光率为（1.3379± 0.0009），25℃条件下测定其Zeta电位平均值为-11.8mV，平均粒径为137.9nm，偶联率为895ng。VEGFR-3抗体/1mg人参皂苷Rg3、5-氟尿嘧啶（5-Fu）注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批号：201203211；VEGF-D一抗，购于英国Abcam公司；即用型免疫组化Maxvision2鼠兔通用型免疫组化检测试剂盒，购于福州迈新生物技术开发有限公司；cDNA第一链合成试剂盒，购自Fermentas Trizol公司。

2 实验方法

2.1 造模、分组与给药取皮下种植生长的NUGC-4-RFP胃癌肿瘤，在培养液中分割成1mm×1mm的组织碎块。采用肌肉注射麻醉的方法麻醉小鼠，待裸鼠痛觉消失后，在8倍外科手术用显微镜下，采用显微外科手术的方法，用手术剪在裸鼠左腹部做一1cm的纵切口，剪开皮肤和腹膜，暴露胃。用8-0外科手术用线将1块NUGC-4-RFP组织碎块植入裸鼠胃大弯部，之后用5-0外科缝线关闭腹腔，整个操作过程在超净工作台中完成。24只裸鼠同时造模后，按随机数字表法分为生理盐水组、5-Fu组和VRIN组，每组8只。造模后第9天开始给药。生理盐水组给予生理盐水尾静脉注射，每只0.2mL/次，Q2d×15；5-Fu组给予5-Fu注射液腹腔注射，按照20mg/kg标准，每周1次，连续3周；VRIN组给予VRIN尾静脉注射，按照1mg/kg标准，Q2d×15。各组药物干预结束后，经麻醉脱颈处死荷瘤鼠，将裸鼠解剖并进行开放式荧光成像，根据红色荧光的表达来判断淋巴结转移情况。快速切取原发肿瘤和转移灶，分别置于4%甲醛与液氮中备用。

2.2 胃癌组织中VEGF-D蛋白表达检测按照试剂盒说明书方法检测移植瘤组织中VEGF-D蛋白表达情况。二甲基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，脱水，透明，封片，镜检。在10×20倍视野下选取3个视野，用计算机图像分析系统对所选视野进行图像采集，并用Moti Image Advaneed 3.0图像分析软件检测其阳性信号，以平均光密度值反映VEGF-D表达的强弱，光密度值越高，VEGF-D的表达就越强。

2.3 胃癌组织中VEGF-D mRNA表达检测采用Real time-PCR方法。取胃癌组织，使用TRIZOL试剂提取肿瘤组织总RNA，检测吸光度（A）值，所提取的RNA纯度A260/A280均在1.8～2.1。按照逆转录试剂盒说明书，将总RNA逆转录成cDNA，以GAPDH为内参照进行Real-time PCR。引物的设计与合成：参照GenBank中的基因序列，使用Primer Premier 5.0进行设计。

GAPDH引物序列——GAPDH上游引物F：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物R：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'，扩增片段为137bp；VEGF引物序列——VEGF-D上游引物F：5'-GGACTCTCGCTCAGCATCCCATC-3'，VEGF-D下游引物R：5'-CCACCTCCACGCACGTTTCTCTA-3'，扩增片段为131bp。上述引物均由上海捷瑞生物科技有限公司合成。PCR反应：反应体系为25μL，SYBR Green PCR Master Mix（2×）10μL，10μmol/L上下游引物各1μL，双蒸水7μL，cDNA 1μL。反应条件：95℃变性5min，95℃15s，60℃30min，共40个循环，扩增完毕后，进行溶解曲线分析，每个标本均作3个复孔；PCR产物定量的校正和判定分析：采用GAPDH作为内参照。VEGF-D mRNA和GAPDH mRNA根据标准曲线得出mRNA的分子拷贝数，用GAPDH的拷贝数作为校正基数，即目的基因mRNA精确含量=目的基因Ct值/内参照GAPDH Ct值，以此比值作统计处理。

2.4 统计学方法所有数据采用SPSS19.0软件处理，计量资料用（±s）表示，首先用Levene检验（Homogeneity of variance test）进行方差齐性检验，如方差齐，采用完全随机的方差分析（ANOVA），多个均数的比较用LSD-t检验；如各个组总体方差不齐，则采用Kruskal-Wallis检验，检验水准（α）定为0.05。

3 实验结果

3.1 各组淋巴结转移情况比较当生理盐水组肿瘤平均体积达到1278.6mm3时结束实验。裸鼠被解剖后，荧光系统观察可见部分动物肠系膜、腹主动脉旁及腹股沟等淋巴结肿大。生理盐水组、5-Fu组和VRIN组的淋巴转移率分别为87.5%（7/8）、50.0%（4/8）和12.5%（1/8）。与生理盐水组比较，VRIN组淋巴转移率明显降低（P＜0.01），而5-Fu组降低无显著性意义（P＞0.05）；VRIN组与5-Fu组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。对切除标本进行HE染色显示移植肿瘤及转移淋巴结均为低分化腺癌。

3.2 各组原位移植瘤组织中VEGF-D蛋白表达比较见表1。各实验组肿瘤组织中均可见到VEGF-D阳性染色，阳性表达细胞以肿瘤细胞为主，主要定位于细胞浆内。两用药组肿瘤组织中VEGF-D蛋白表达均明显低于生理盐水组（P＜0.05），两用药组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组原位移植瘤组织中VEGF-D蛋白表达比较（±s）

表1 各组原位移植瘤组织中VEGF-D蛋白表达比较（±s）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05。

3.3 各组原位移植瘤组织中VEGF-DmRNA表达比较见表2。与生理盐水组比较，VRIN组、5-Fu组均可下调VEGF-D mRNA表达水平，VRIN组差异有统计学意义（P＜0.05），而5-Fu组差异无统计学意义（P＞0.05）；两用药组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组原位移植瘤组织中VEGF-D mRNA表达比较（±s）

表2 各组原位移植瘤组织中VEGF-D mRNA表达比较（±s）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05。

4 讨论

防治肿瘤的复发和转移仍是目前胃癌防治工作中的重点和难点。淋巴转移是胃癌转移的主要途径，近年来，随着VEGF-C和VEGF-D等淋巴管生长因子的发现，使胃癌淋巴转移机制研究得以深入。VEGF-D是血管内皮生长因子家族的新成员，位于Xp22.34[3]。VEGF-D是目前已知的促淋巴管生长因子，可诱导淋巴管生成，促进肿瘤细胞的淋巴转移，在淋巴管生成机制中起重要作用。VEGF-D与其受体VEGFR-3的胞外区域高度特异性结合，使受体自身磷酸化而激活细胞内信号传导通路，刺激淋巴管内皮细胞的增殖和迁移，诱导淋巴管生成，参与体内多种病理生理过程。VEGF-D在胃癌等多种肿瘤细胞中都有表达，与胃癌的预后密切相关[4-5]。

人参作为传统中药家喻户晓，其提纯的重要活性成分之一的人参皂苷Rg3分子式是C42H72O13，属四环三萜类人参二醇型皂苷单体，其抗肿瘤作用已从多发面被证实，包括：诱导肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞、抑制肿瘤细胞侵袭和转移、抑制肿瘤血管新生、逆转化疗耐用、调节肿瘤细胞基因及蛋白表达[6-7]。我国自行开发的第一个在临床应用的抗肿瘤中药一类新药参一胶囊的主要活性成分就是Rg3。然而Rg3口服后血浆浓度很低，3.2mg/kg口服后的Cmax值仅为（15.67±6.14）ng/mL[8]。为了提高Rg3在体内的生物利用度，需要设计一种更加安全高效的Rg3制剂。

本课题研究的人参皂苷Rg3免疫纳米乳剂（VRIN）是采用聚乙二醇法制备，将VEGFR-3抗体与人参皂苷Rg3纳米乳结合的新制剂。研究证实人参皂苷免疫纳米VRIN组对胃癌NUGC-4细胞裸鼠移植瘤淋巴结转移有明显抑制作用，与生理盐水组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；下调肿瘤组织中VEGF-D蛋白和mRNA水平的表达，与生理盐水组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。因此人参皂苷免疫纳米VRIN可有效抑制胃癌淋巴结转移，调控淋巴管生长因子VEGF-D蛋白和mRNA水平的表达，可能是VRIN防治胃癌淋巴转移的作用机制之一。

本研究中利用可稳定表达红色荧光的裸鼠原位移植胃癌模型对人参皂苷Rg3免疫纳米乳剂（VRIN）抗胃癌转移作用进行了探索研究，目前国内外尚未见相似报道。研究结果提示VRIN是一种非常有潜力的抗胃癌转移治疗药物，值得进一步深入研究。

[1]邓靖宇.淋巴结转移在胃癌临床研究中的现况.中国肿瘤临床，2013，40（22）：1370

[2]Schimanski CC，Schlaegel F，Jordan M，et al.VEGF-D correlates with metastatic disease in gastric cancer patients undergoing surgery.World J Surg，2011，35（5）：1010

[3]Mohammed R.A，Gree A，El-shikh S，et al.Prognostic significance of vascular endothelial cell growth factors–A，-C and -D in breast cancer and their relationship with angio-and lymphangiogenesis.Br J Cancer，2007，96（7）：1092

[4]Kim JY，Jeon TJ，Bae BN，et al.The prognostic significance of growth factors and growth factor receptors in gastric adenocarcinoma.APMIS，2013，121（2）：95

[5]Shida A，Fujioka S，Ishibashi Y，et al.Prognostic significance of vascular endothelial growth factor D in gastric carcinoma. World J Surg，2005，29（12）：1600

[6]张翔，叶宝东，陈丹，等.人参皂苷Rg3抗肿瘤机制研究进展.中华中医药学刊，2013，31（2）：328

[7]Choi YJ，Lee HJ，Kang DW，et al.Ginsenoside Rg3 induces apoptosis in the U87MG human glioblastoma cell line through the MEK signaling pathway and reactive oxygen species.Oncol Rep，2013，30（3）：1362

[8]Wang H，Zou H，Kong L，et al.Determination of ginsenoside Rg3 in plasma by solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography for pharmacokinetic study.J Chromatogr B Biomed Sci Appl，1999，731（2）：403

R735.2

A

1672-397X（2014）08-0076-03

戴小军（1979-），男，医学硕士，主治医师，主要从事肿瘤中西医临床与基础研究工作。dxj2319@sinan.com

2014-03-02

编辑：吴宁

国家自然科学基金资助项目（81001589）；江苏省中医药局科研项目（HZ07101）