乳酸菌亚硝酸还原酶代谢调控研究进展

周 通，徐 波

(江西农业大学生物科学与工程学院，江西 南昌330045)

1 亚硝酸盐污染是发酵食品生产中亟待解决的关键问题

我国蔬菜深加工产品-酱腌菜生产历史悠久，品种繁多。食用酱腌菜，可摄入益生菌-乳酸菌及其代谢产生的有机酸等，促进胃肠蠕动，防止便秘，刺激肠道免疫细胞产生抗体，抑制肠道腐败细菌生长，减弱腐败菌在肠道产毒，防止细胞老化，降低胆固醇，调节人体生理功能等保健和医疗作用。

但是蔬菜在腌制和贮藏过程中极易产生亚硝酸盐污染。由于亚硝酸盐可与食品中蛋白质分解产物次级胺(仲胺、叔胺、酰胺及氨基酸)结合，生成强致癌的N-亚硝基化合物，长期摄入亚硝酸盐有致突变和致癌的危险，可诱发肝癌、食管癌、胃癌等多种癌症和疾病。随着人们食品安全意识的提高，发酵食品中亚硝酸盐污染的安全问题也日益受到人们的关注，如何降解亚硝酸盐类物质是发酵食品生产中亟待解决的关键问题［1］。

2 利用食品级亚硝酸盐还原酶降解发酵食品中产生的亚硝酸盐，是应对亚硝酸盐污染的根本对策，对保障我国食品安全具有重要意义

目前，国内外对蔬菜加工中亚硝酸盐的研究主要集中在蔬菜发酵过程中亚硝酸盐变化规律，而对亚硝酸盐的降解机理研究，以及影响亚硝酸盐的微生物菌系及其相关酶系等则研究甚少。利用微生物降解亚硝酸盐是当前的研究重点和热点。微生物降解亚硝酸盐主要是利用亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase，Nir)降低亚硝酸盐含量［2］，尤其是利用食品级安全菌株-乳酸菌产生的亚硝酸盐还原酶彻底降解亚硝酸盐是应对亚硝酸盐污染的根本对策，对保障我国食品安全具有重要意义［3］。

3 乳酸菌亚硝酸盐还原酶的分子调控机制尚不明晰

从生物脱氮理论分析亚硝酸盐降解有羟胺途径还原成氨气和还原成氮气2个途径。一些兼性厌氧细菌能利用硝酸氮为营养，在硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的作用下将硝酸盐还原为氨，进而生物合成氨基酸、蛋白质和其它含氮有机物。

迄今为止，人们共发现了4种类型Nir，其中nirK编码的可溶性含铜酶和nirS编码的细胞色素cd1还原酶被广泛研究。这2种酶在限氧和厌氧条件下以N代替O2作为电子受体构成氧化呼吸链，使N接受电子被还原为NO，它们虽然在结构上有差异，但功能和生理上无差异［4，5］。nrfA编码的细胞色素C亚硝酸盐还原酶和nasB编码的亚硝酸盐同化还原酶催化N还原为N，其主要差别是前者将N排放到细胞外，后者利用N合成氨基酸［6］。

NirS分子量约为120KDa，由2个相同的亚单位组成，每单位含一个e型和d1型血红素，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)Nir晶体结构的研究表明:c亚铁血红素是电子进入位点，而d1是底物结合和催化的活性中心［7］。NirK为三聚体，每个亚单位有2个铜原子，分子量为36KDa，2个铜原子组成Ⅰ型(蓝色)铜活性中心和Ⅱ型(非蓝色)铜活性中心。Ⅰ型与亚单位内的基团结合，Ⅱ型与三聚体中2个亚单位的基团结合，Ⅰ型被认为是电子由供体流向Nir的入口，Ⅱ型则被认为是催化中心，亚硝酸盐结合在Ⅱ型上［8］。

在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、Pa.denitrificans和斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中，nir和一氧化氮还原酶(Nor)的结构基因(nor)在染色体上相距10 kb，是一对连锁基因［9，10］，并且nir与相关基因也常常发生连锁。在P.aeruginosa中，11个nir相邻基因表达产物都与Nir活性有关［11］，有些基因以同一方向转录至一条mRNA中［12］。然而，在P.stutzeri细胞内，有些基因被重新排列，相关基因不再相邻，且转录至3条或3条以上mRNA中［13］。

目前对Nir的生化和分子机理研究主要集中在反硝化固氮菌如P.stutzeri和Pa.denitrificans的研究，而对乳酸菌的nir操纵子(nir operon)和转录调控蛋白结构、功能及调控机制的研究鲜有报道，其分子调控机制尚不清楚。

4 研究乳酸菌氮代谢全局性转录调控蛋白GlnR对Nir的调控机制，不仅是揭示亚硝酸盐降解的分子调控机制的首要研究内容，也是加快消除发酵食品、饲料中亚硝酸残留等问题的必要基础

革兰氏阳性细菌已进化出复杂、多样的氮代谢调控机制，而氮代谢全局性转录调控蛋白GlnR广泛存在于革兰氏阳性细菌中，对很多参与氮代谢的基因都有调控作用。氮代谢途径的相关基因中，glnA、gdhA、glnPQ、amtB、nirBD、ureA、glnK、glnD等均受GlnR的调控［12，14］。目前发现的GlnR既有MerR家族也有OmpR家族，针对可利用氮源的变化，GlnR可以抑制或激活氮代谢相关基因的表达。因此，研究GlnR介导的代谢调控有助于深入了解细菌中心氮代谢，对研究氮代谢调控中的信号传导等具有重要的意义。

最近，通过生物信息学手段搜寻与GlnR结合序列的启动子，结合体外实验，在天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)中发现10个GlnR靶标，这些基因主要有负责氮的吸收和调节的操纵子(amtB-glnK-glnD)，亚硝酸盐和硝酸盐的降解基因(nirB和nasA)，脲酶基因(ureA)以及谷氨酸和谷氨酰胺合成基因(glnA，glnII和gdhA)，GlnR主要对其靶基因起激活或抑制作用。在氮源限制时，GlnR可以激活glnA，glnII，amtB和nirB的表达，并抑制gdhA(编码GDH)和ureA(编码尿酶)的转录［15，16］。Rafat等人发现S.coelicolor的一个GlnR新的靶基因-nnaR(硝酸盐和亚硝酸盐降解调控子)编码一个转录调控蛋白，其N端为推定的类-HemD酶区域，C端为DNA结合域，NnaR不是酶激活蛋白但作为GlnR共激活因子调控硝酸盐和亚硝酸盐还原酶基因的转录［17］。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为最典型的低G+C含量革兰氏阳性菌模式菌株，其氮代谢转录调控机制已有详尽的报道［18］。2个MerR家族的调控蛋白GlnR和TnrA，以及全局调控蛋白CodY相互协调控制氮代谢相关基因的表达，以保证枯草芽孢杆菌在不同氮源条件下获得充足的氮源。GlnR和TnrA通过感应谷氨酰胺的浓度来实施调控，它们识别相同的操作子序列(TnrA/ GlnR识别位点，5-T6TNA-7NTNACAT-3)。GlnR可以抑制其所在操纵子glnRA以及脲酶操纵子ureABC，甚至tnrA基因的表达，而TnrA可以激活或抑制氮代谢相关基因的表达。TnrA只有在氮源受限时被激活，而 GlnR在氮源过量时被激活［19～21］。通过BLASTP程序比对NCBI的乳酸杆菌基因组，结果发现几乎所有的乳酸杆菌中均无TnrA的同源物，只有GlnR调控蛋白，并且乳酸杆菌存在多种氨基酸营养缺陷型。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis MG1363)是乳酸菌的模式菌株，Rasmus Larsen［22］等通过构建乳酸乳球菌glnR缺失突变株结合DNA微阵列方法发现了10个GlnR靶标，其中包括直接靶标gln-RA操纵子(铵转运及感应操纵子amtB-glnK和谷氨酰胺/谷氨酸ABC转运蛋白编码基因glnPQ)。乳酸乳球菌glnR缺失突变株中glnA、amtB-glnK操纵子的表达被高度抑制，amtB-glnK启动子-35区上游的GlnR盒对GlnR介导的抑制作用极为重要。

GlnR不仅参与细菌的氮代谢调控，同时也与细菌的多种代谢途径存在交叉调控。随着研究不断深入，越来越多氮代谢相关基因被发现受GlnR的调控，GlnR的调控作用甚至与细菌毒性、次级代谢、磷酸盐同化等方面均有关［23］。但是GlnR对这些靶标基因的间接调控作用有待于进一步的研究。深入研究GlnR在其它代谢途径中的作用，对进一步阐述GlnR参与次级代谢活性产物、细菌形态分化、细菌毒性等的调控具有重要的意义。

5 研究乳酸菌亚硝酸还原酶代谢调控意义

随着更多细菌基因组测序的完成，结合强有力的生物信息学预测手段，以及高通量技术的应用，如蛋白质组技术、DNA芯片技术等，为理清全局调控网络之间的复杂关系提供了有效手段，越来越多的GlnR靶标被发现，其中不乏间接靶标，但是GlnR对这些靶标基因的间接调控作用有待于进一步的研究。虽然几个菌属中GlnR的调控模式已经研究得很详细，但调控GlnR活性的信号和机制目前还不是很清楚，亟须更深入的研究。可见，构建乳酸菌氮代谢的基因转录网络、明确基因转录的相互调控关系和关键调控基因已具备了必须的技术条件;基因转录的相互调控关系和关键调控基因的明确不仅是揭示亚硝酸盐降解的分子调控机制的首要研究内容，也是加快消除发酵食品、饲料中亚硝酸残留等问题必要基础。

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