动物昼夜节律相关miRNAs研究进展

葛 莹，狄 冉，储明星，刘秋月，胡文萍，王翔宇

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室，北京100193）

在昼夜不断更替的循环下，动物的行为和生理方面都发生了显著变化。这是由于动物应对环境变化（如食物供给、捕食风险、温度以及光照等）长期选择的结果。因此动物天生具有计时机制，也就是昼夜节律钟，它能驱使生理和行为发生昼夜节律性变化。根据环境信号特别是光照，昼夜节律钟每日重置并且保证内源节律24h与此同步。为了更好地理解昼夜节律生物钟，相关学者探讨了miRNA 在昼夜节律中的潜在影响。

1 miRNA 概述

近年来，研究者发现一类新的转录后调控因子－microRNAs（miRNAs），作为小的单链RNA 分子，长度为22nt左右，由基因组非编码区域转录而来［1－2］。这一过程是由RNA 聚合酶Ⅱ加工成的前体pri－miRNA，其具有5′端帽子结构和3′端PloyA尾巴结构，然后被剪切成约70nt具有发夹结构的单链RNA［1，3］。在细胞核中，pri－miRNA 在RNaseⅢ酶Drosha 以及其他辅助因子的作用下被加工［4－5］，从而产生具有茎环结构的前体pre－miRNA。然后由依赖Ran的核转运受体家族成员转运蛋白5（Exp5）将pre－miRNA 从胞核运到胞质；到达胞质后，pre－miRNA 在胞质核酸酶RNaseⅢdicer参与下进行第二次加工，pre－miRNA 被裂解成miRNA双链，随后它的一条链保留成为成熟的miRNA［6－8］，而另一条链有些被未知RNA 酶降解，有些也可以作为成熟miRNA。成熟的miRNA 与RNA 诱导沉默复合体（RNA－induced silencing complex，RISC）结合并形成miRNP，之后该复合物会结合到靶mRNA 上，抑制靶基因的表达，从而发挥作用［9－11］。miRNA 通过与靶基因的3′UTR 区碱基配对来调控基因的转录后表达，大部分miRNA 通过与mRNA 结合降解mRNA 或者抑制翻译过程，只有少数miRNA 可以增加靶基因的表达。

1993年，科学家首次在秀丽隐杆线虫中发现了2个miRNA（lin－4及let－7），并确定了它们在线虫发育中的时间调控作用［12］，随后大量的miRNAs相关研究使得人们对miRNA 的功能机制理解得越来越清楚。在哺乳动物中，约60%的编码蛋白基因受到miRNA 的分子调控［13］，并且参与调节了多个生理活动，包括细胞增殖与分化、激素分泌、新陈代谢、肌肉和脂肪的形成发育、免疫应答反应、疾病的发生和肿瘤的形成等。

2 昼夜节律的分子机制

哺乳动物的昼夜节律系统是由作用于中枢生物钟和外周节律震荡器组成的，其中中枢生物钟定位于下丘脑中的视交叉上核（suprachiasmatic nuclei，SCN），而外周节律震荡器则分布于外周各器官组织。中枢生物钟自身与每日昼夜循环产生的外部信号同步，并且将信号传递给其他多个组织特异性的生物钟［14］。作为昼夜节律的基础，这种分子机制存在于每个细胞中，由自主转录反馈回路组成。调控节律震荡的分子通路的核心转录元件是CLOCK／BMAL1（Brain and Muscle Arnt－Like 1）复合物［15－16］。由于启动子中存在E－box（钟特异的序列）增强子元件，这种异源二聚体能够作为转录因子来诱导节律输出基因－钟控基因（clock－controlled genes，CCGs）的表达［17］。下游的CCGs 也是CLOCK／BMAL1的负调控因子，包括Period基因家族（Per1、Per2 和Per3）、隐色素基因（Cry1 和Cry2）以及Rev－Erbα基因［16，18，19］。Rev－Erbα可与Bmal1 启动子结合，阻遏Bmal1 的转录，导致CLOCK／BMAL1的活性受到抑制以及CCG 的表达量降低［20］。这一抑制模式引起BMAL1 mRNA表达水平的循环变化，而CCGs的表达水平在其反相位上循环变化。在细胞核内，当BMAL1、Per和Cry蛋白中的其他负调控因子表达量最高时，它们就能抑制E盒依赖型基因表达［18］。这样，一旦分子生物钟重置，就会开始一个新的循环。对于钟基因的表达调控研究主要集中在转录和转译后的修饰，但是转录后的变化过程也对这些基因起着重要的调控作用。Per蛋白的磷酸化和降解能够调控哺乳动物生物钟的时间设置。另外，Bmal1和Cry蛋白经过磷酸化、泛素化、SUMO 化以及乙酰化作用可在转录后水平控制自身的活性。

目前在哺乳动物体内已经鉴定出至少8种生物钟相关的基因，包括Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1和Timless基因等。生理上的昼夜节律是由复杂的基因表达调控产生的，这些基因的表达与多种因素有关，包括转录的调控节律性、转录后调控的时间依赖性以及翻译和翻译后调控的局限性。其中，严格的转录调控对校正节律循环的必要性已经得到验证［21］，而且转录后调控对微调昼夜节律具有非常重要的影响［22］，因此miRNAs具有调控昼夜节律的能力［23］。

3 miRNA 对昼夜节律的调控

自从发现调节昼夜节律的分子机制以来，严格的转录调控就被认为是校正昼夜循环必不可少的组成部分。最近，转录后元件也被认为参与生物钟调控。而miRNAs的作用类似于分子控制开关，并且能够调控成百上千的基因表达。

通过TargetScan、PicTar以及microrna.org等生物信息学研究工具，能够成功预测与昼夜节律相关的miRNAs。Figueredo等［24］预测了69个miRNAs与动物昼夜节律相关，其中三分之一已有文献报道，某些miRNAs通过与钟基因的靶关系来调控昼夜节律。具有节律性表达的miRNAs不一定与动物的昼夜节律相关，无节律性表达的miRNAs却可能在昼夜节律中发挥着重要作用［25］。

3.1 miRNA 对中枢生物钟机制的调控

在小鼠的视网膜和视交叉上核、果蝇的大脑以及拟南芥中，已发现一些miRNAs呈节律性表达。还有一些miRNAs直接参与生物钟系统，能够受光照诱导或调控节律周期。

Cheng等［26］研究发现，在SCN 中miR－132 和miR－219的表达具有节律性，而且都属于CCGs。miR－219能够调节小鼠的生理节律和缩短昼夜周期，而miR－132 是光复位时钟的负调控因子。其中，miR－219可以缩短昼夜周期10～20min，但是这种miRNA 能够改变昼夜周期的确切机制还有待验证。在这两个miRNA 靶基因中没有发现生物钟的核心元件，表明这些miRNAs通过间接机制影响生物钟。依赖cAMP 效应元件和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）机制，miR－132对光照进行调控，并且能够促进光诱导相位延迟。相反，miR－219 由CLOCK／BMAL1驱动，并且敲除内源性miR－219导致节律周期变长。

除此之外，Nagel等［27］也发现一类miRNAs能够调控生物钟的核心元件。通过正向遗传学筛选，他们发现miR－192／194族能够抑制Per家族所有基因的表达，从而说明miR－192和miR－194是重要的昼夜节律调控因子。在NIH－3T3 细胞中，过表达miR－192／194能显著缩短昼夜节律周期，可能是由于这些miRNAs抑制Per基因的表达引起的，基因敲除小鼠Per1、Per2和Per3导致昼夜周期分别缩短约1、1.5和0.5h。因此miR－192／194在转录后水平调控核心钟基因蛋白。推测miR－192／194 抑制部分Per基因的表达可能达到类似完全丧失整个Per基因对昼夜节律钟的效果。同样，Chen等［28］也证明了miRNA 介导的RNA 干扰在转录后水平调控核心钟基因，通过控制Per基因表达水平来调控昼夜节律。

果蝇是研究最广泛最深入的实验动物模型，它在昼夜节律研究进展方面扮演着重要的角色。早在20世纪70年代，人们就对果蝇的昼夜节律进行遗传分析。Yang 等［29］发现在野生型果蝇的头部，dme－miR－263a以及dme－miR－263b 有明显的周期性，但在突变型中丧失表达的节律性，进一步研究发现这两个miRNAs在持续黑暗中周期性表达。通过原位杂交分析这些在头部特异性表达的miRNAs，结果显示这些miRNAs在个别神经元中表达水平变化较大，从而揭示miRNAs固有的表达可能是中等水平的变化，说明这些miRNAs对钟基因表达具有精细调节的作用。此外，还预测某些钟基因可能是昼夜节律的miRNA 的靶基因，如Per、clock、tim、dbt、cwo和tws。

Cry1基因也是分子钟系统的核心基因。它的转录周期对维持钟基因节律性表达至关重要，但是通过转录后和翻译后的调控能够微调节律周期。miR－185能够与mCry1（mouse Cry1）的3′UTR 结合，从而在转录后水平调控mCry1 的表达。Lee等［30］发现，细胞质中的miR－185 水平和mCry1 蛋白水平呈负相关，并且敲除miR－185 能够提高mCry1蛋白水平变化的幅度。因此，miR－185控制mCry1mRNA 翻译速率的节律性，从而对mCry1蛋白表达进行微调控。

3.2 miRNA 对外周节律震荡器的调控

3.2.1 miRNA 对肝脏中节律震荡器的调控 在肝脏中，大多数代谢通路受昼夜节律调控，并且成百上千的蛋白编码基因以循环的方式转录。Na等［25］通过Microarray表达谱分析研究了在48h内每隔4h小鼠肝脏miRNA－mRNA 表达情况。其中昼夜节律的转录因子Clock和Bmal1与其对应的miR－181d和miR－191表达方式呈负相关，而昼夜节律的抑制因子Per、Cry、CKIe和Rev－erba表达方式与其对应的miRNAs表达方式呈正相关。该研究表明小鼠肝脏中miR－181d和miR－191能够通过调节Clock和Bmal1复合物参与外周昼夜节律的调节。

miR－122在昼夜节律钟中的作用很有趣，它与昼夜节律之间也有功能性相关，它是肝脏中特异性表达的miRNA。转录过程中miR－122在pre－miRNA 时呈节律性，成熟的miRNAs 却保持稳定。Nocturnin是昼夜节律下游的脱腺苷化酶（deadenylase），被认为是转录后调控的关键因子，具有生物节律性，在RNA 水平具有明确的日节律变化，并且在夜间呈现高表达状态［31］。miR－122 和脱腺苷酶Nocturnin之间具有靶关系，并且miR－122 对构建Nocturnin昼夜节律表达谱具有重要的作用［32］。miR－122对Nocturnin表达的调控是联系昼夜节律钟和肝脏脂肪代谢的重要枢纽。

3.2.2 miRNA 对外周血液中节律震荡器的调控

Shende 等［33］发现，miR－142－3p 特异性结合到Bmal1的3′UTR，并且过表达miR－142－3p 能够引起SCN 细胞中BMAL1蛋白昼夜节律变化的模式发生改变。由于Bmal1在全身各组织和细胞中广泛表达并且具有昼夜节律，因此miR－142－3p可能对外周生物钟的核心元件具有类似转录后调控的作用。与其它miRNA－靶基因相比，miR－142－3p 与Bmal1的关系很特殊，miRNA 抑制Bmal1的表达，但Bmal1却能够刺激miRNA 表达。另外，之前的研究表明miR－142－3p通过抑制T 细胞中的腺苷酸环化酶9（adenylate cyclase 9，ADCY9）的表达能够调节cAMP 水平［34－35］，大鼠SCN 中cAMP 的表达在白天和夜晚都出现波峰并且cAMP 信号通路参与调控SCN 昼夜节律［36］。因此，miR－142－3p可能在SCN 的生理节律上起到重要作用。它不仅调控核心钟基因Bmal1，也调控钟控输出元件cAMP，因此miR－142－3p通过重置或微调对生物钟机制进行反馈调节。还发现同时过表达miR－142－3p和miR－494能降低内源性Bmal1 水平，增加Per2 震荡周期，并且培养基中细胞外的miR－143－3p／miR－494丰度升高；miRNA 表达量高的培养基能够增加miR－142－3p在细胞内的表达，并且抑制原态细胞（navïe cell）中Bmal1 3′UTR 活性；膜泡运输的抑制因子调控这些miRNAs 在细胞内的交流以及Per2的总体节律性。因此miR－142－3p和miR－494可能像顺式作用元件和反式作用元件那样协调细胞自主昼夜节律钟［37］。

目前只有少数研究报道miRNAs与静息－活动节律有关［26，38］，并参与生物钟功能或是输入方式，而不是生物钟输出方式。Luo等［39］报道了miR－279的缺失不会影响中枢生物钟，但是却会破坏静息－活动节律，这说明该miRNA 是生物钟输出通路的调控元件。他们将miR－279 与节律相关的靶基因称为unpaired（upd）－JAK／STAT 通路的配体，并且发现调控这一通路会破坏静息－活动节律。

3.2.3 miRNA 对视网膜中节律震荡器的调控

为了研究斑马鱼中miRNAs可能对光输送和生理节律的调控，研究人员已利用miR－seq筛选出在斑马鱼松果体中表达量高的光诱导的miR－NAs［40］，经过分析发现miR－183／96／182 在松果体中的表达量非常高并且被光照上调。之前已经发现这个miRNA 族在小鼠视网膜中表达水平呈日动态变化，并且对昼夜节律的调控作用也得到了证实－通过与钟控制基因ADCY6的靶向结合调控褪黑激素合成［41］。miR－183通过与光诱导的E4BP4－6 和钟控芳烷基胺N－乙酰转移酶2（Arylalkylamine－Nacetyltransferase 2，AANAT2）靶位点结合，从而下调mRNAs水平。此外，体内敲除试验表明，miR－183有助于AANAT2mRNA 在松果体内表达水平呈节律性［42］，随后又发现小鼠视网膜中的miR－183／96／182受光调控并且靶向调控SLC1A1（兴奋性氨基酸酸转运体3）［43］。

3.3 影响昼夜节律的miRNA 与疾病的关系

机体内，除了神经调节、体液调节以及免疫系统，昼夜节律是一个重要的调控系统，能维持生物体处于正常的生理水平。昼夜节律异常可能使细胞功能下降，从而潜在地增加疾病发生的可能性，包括癌症［44］。有研究表明哺乳动物基因组中10%的基因受昼夜节律基因的调控［45］。在细胞中，因为分子钟机制调控与细胞周期、细胞凋亡以及其它通路相关的基因表达，所以昼夜节律基因的畸变会导致生理过程的异常以及肿瘤的产生［46］。目前，miR－124作为肿瘤抑制因子被广泛研究。它在胶质瘤中常常被沉默，可能是miR－124－1启动子甲基化造成的［47］。Li等［48］研究发现人类恶性胶质瘤和其细胞系中CLOCK表达水平显著增加，而miR－124表达量下降。miR－124与CLOCK的3′UTR 靶向互补，miR－124受到抑制导致CLOCK基因的表达量增加。通过增强NF－ΚB的活性，CLOCK正调控神经胶质瘤的增殖和迁移。

4 展望

近几十年来，随着研究者对miRNAs的广泛研究，我们对其调控机制和功能有了更深入的理解，并且昼夜节律的转录－翻译反馈模式和miRNAs对昼夜节律的转录后调控机制已经得到证实。核心生物钟与分散的外周震荡器共同协调动物在昼夜之间生理和行为上的同步，但是它们之间相互作用的机制还不清楚。目前，该类研究还在不断地进行，未来将验证昼夜节律中的miRNAs的特异性靶基因和调控网络，为更加深入地阐明昼夜节律调控机制奠定基础。

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