胚胎干细胞的研究进展
2014-04-15香综述金玉姬审校
曾 香综述,金玉姬审校
(吉林医药学院:1.2010级预防医学本科班,2.基础医学院,吉林 吉林 132013)
·综 述·
胚胎干细胞的研究进展
Research progress of Embryonic stem cells
曾 香1综述,金玉姬2*审校
(吉林医药学院:1.2010级预防医学本科班,2.基础医学院,吉林 吉林 132013)
胚胎干细胞是来源于胚胎内细胞团的具有多向分化潜能的一类干细胞,自从20世纪70年代开始研究胚胎干细胞以来,已经广泛用于生命科学的许多领域。本文综述了近些年关于胚胎干细胞建系、分化和应用的研究进展,同时也指出了目前所面临的问题。
胚胎干细胞;临床应用;研究进展
胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)是一种从早期胚胎的囊胚内细胞团细胞或胎儿原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)中经分离、体外抑制分化培养得到的具有发育全能性(或多能性)的一类干细胞。与已经成熟分化的体细胞一样,ES细胞也是一分为二地分裂增殖,且ESC具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。在一定的培养条件下,ES细胞可以在体外长久和稳定地自我复制,实现“永生”。无论在体外还是体内环境,ES细胞都能被诱导分化为内、中、外3个胚层的几乎所有类型细胞。因此,ES细胞成为研究哺乳动物早期胚胎发生、细胞组织分化、基因表达调控等发育生物学基础研究的一个非常理想的模型系统和非常有用的工具,也是进行动物胚胎工程开发和用于治疗各种疾病,修复受损伤的组织和器官的一个重要途径,具有广泛的应用前景[1]。1999年,《Science》将干细胞研究评为21世纪最重要的10项研究领域之首,ES细胞的建立、研究和应用被认为是继“人类基因组计划”之后,医学、生命科学上的又一革命性进展。
1 ES细胞的基本概念及其研究历史
胚胎干细胞研究的起源来自20世纪70年代对畸胎瘤的研究:有人把早期的小鼠胚胎移植到成年小鼠体内后产生了畸胎癌(即恶性的畸胎瘤),畸胎癌内的细胞(即EC,胚胎癌细胞)能在体外自我更新且能分化成不同种类的细胞,由于这种类型的畸胎癌只能由着床前的早期小鼠胚胎产生,因此推测EC细胞的来源是胚胎发育早期短暂出现的外胚层细胞(epiblast)。关于EC细胞的研究使科学家认为可能从小鼠早期胚胎中分离到一种能分化成多种细胞的具有全能性的干细胞,即胚胎干细胞(ESC)。2001年美国国立卫生院根据Austin Smith对小鼠ES细胞的研究,对其概念提出了一系列标准[2]。自从1981年Evans和Kaufman从延缓着床的小鼠囊胚内细胞团(ICM)中分离出胚胎干细胞后,全球就掀起了胚胎干细胞研究的热潮。1998年,美国威斯康星大学的Thomson教授在建立灵长类动物胚胎干细胞系的基础上,建立了人类胚胎干细胞系(hES);同年,另一研究小组用流产胎儿性腺成功地分离和培养并建立了人胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EG细胞)系[2]。国内在细胞胚胎干方面的综合性研究虽然起步较晚(1989年),但发展非常迅速。在基础研究方面,尚克刚、赖学良等已先后建立了小鼠和兔细胞系,盛惠珍研究小组在国际上首次构建了人-兔核移植重构胚。在应用研究方面,窦忠英的科研小组已第6次从人类胚胎干细胞中分化诱导得到心脏跳动样细胞团,中国军事医学科学院发现了“人胚胎干细胞素”,用于临床多种疾病的治疗取得了明显效果[3]。
2 ES细胞的基本特性
ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构,细胞体积小,核大,核质比高,有一个或多个明显的核仁,核型正常,具有整倍性。在体外分化抑制性生长时,ES细胞呈克隆状生长,排列紧密,呈鸟巢集落状,难以看清细胞界限,集落边界清晰,有立体感。用碱性磷酸酶染色,ES细胞呈棕红色,而周围的成纤维细胞呈淡黄色。小鼠ES细胞的直径为7~18 μm,猪、牛、羊ES细胞的颜色较深,直径为12~18 μm[4]。
ES细胞具有全能性、无限增殖性、种系传递功能,ES细胞易于进行基因改造操作,并保留了正常二倍体的性质且核型正常,能参与胚胎各组织器官的生长发育等生理功能[4]。
ES细胞表面表达时相专一性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen,SSEA),而且可以检测到Oct-4基因的表达,这两种蛋白为发育全能性的标志。另外,ES细胞中AFP及端粒酶活性较高,可用于ES细胞分化与否的鉴定。hES细胞表达以下所有分子标志物有Oct3/4、TDGF、Sox2、LeftyA、Thy-1、FGF4、Rex1、SSEA3、SSEA4、TRA-1-81、TRA-2-54和GCTM-2,这些分子标志物在未分化的hES细胞中高表达,在分化细胞中不表达或低表达[5]。
3 ES细胞的建系与培养
ES细胞建系,来自由分离的内细胞群细胞、从5~9周的胚胎生殖腺中分离ES细胞。也用克隆技术将体细胞核移植到去核卵母细胞中,使之发育成囊胚,再分离其内细胞群细胞,由这种方法获得的细胞或组织,遗传物质和供体一致,故移植后不会产生免疫排斥反应,Hwang等[6]应用这种方法获得了胚胎干细胞。1981年,Evans等首先建立了小鼠的ES细胞系,在此之后近20年里,人们相继自早期胚胎建立了仓鼠、猪、兔、水貂、大鼠、鱼类、鸟类、牛、灵长类动物(恒河猴、狨)和人的类ES细胞系。从PGCs分离克隆到小鼠EG细胞系后,人们分别自PGCs分离克隆到人、山羊、鸡等类ES细胞[2]。
目前建立的hES细胞株主要来源于临床进行体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)和胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)治疗的患者捐赠的多余废弃的新鲜或冷冻解冻后的胚胎。首先需去除囊胚的透明带,常规的方法为链蛋白酶消化;然后去除外围的滋养细胞层,可用机械法或利用补体介导的免疫手术法分离内细胞团;最后将完整的内细胞团接种在小鼠胚胎成纤维细胞(primary mouse embryo fibroblast,PMEF)饲养层上,后者一般用丝裂霉素处理或放射线照射的方法使其失去增殖能力。一段时间的培养后,hES细胞从内细胞团中长出来,形成集落样的结构,经过反复传代,建成hES 细胞系[7]。
ES细胞需要特殊的培养基。常用改良伊格尔培养基(MEM)α、达氏修正依氏培养基(DMEM)、组织培养基(TCM)199、F12等合成培养基。饲养层细胞能向培养液中分泌多种细胞因子,在一定程度上影响并调节细胞的生长。如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)等细胞分化抑制因子和成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等促有丝分裂因子。培养ES细胞常用的饲养层有STO、SNL(G418R基因和LIF基因转染的STO)、HBC5637、小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)等。PMEF与STO细胞一样也能分泌抑制ES细胞分化的因子LIF,且PMEF与STO细胞相比其形成ES细胞的克隆率、维持ES细胞正常核型的能力及形成嵌合体的能力均比STO细胞要好一些[9]。
hES细胞的培养体系主要分为:含饲养层细胞培养法和无饲养层细胞培养法。
小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)是培养hES细胞最常用的饲养层。胎盘来源的饲养层细胞可以很好地支持hES生长并且不需要添加bFGF,这可能与饲养层细胞增强了内源性bFGF表达或激活hES的ERK1/2-c-Fos/c-Jun信号通路有关。流产胎儿的皮肤和肌肉细胞,以及成人输卵管上皮细胞体外培养后均能够支持hES细胞的体外扩增,而且他们用人血清代替SR或胎牛血清,用这种新的饲养层细胞建立了一株无动物源性蛋白污染的细胞系,为将来安全的将细胞应用于临床治疗带来了希望。不过,即使是人源饲养层也不能排除异体污染的风险,所有目前的ES细胞还是无法满足临床应用的要求[11]。
也用PMEF制备的条件培养液和基质胶(matri gel,作为贴壁基质)建立hES的无饲养层的培养体系;在培养液中添加TGF、LIF及bFGF,辅助以fibronectin也建立了无饲养层培养体系;还可以通过使用特异性化学药物激活Wnt信号途径来维持ES细胞在无饲养层条件下的生长。近年来技术人员通过研究hES自我更新机制有关的信号通路开发出许多无饲养层、无异源污染的培养液,这些培养液中包含一些激活干细胞自我更新通路或抑制其分化的重组生长因子。目前已经有较多商业化的无饲养层、无异源污染的成分明确的培养液出现,但是已被报道可用于hES建系的培养液仅有TeSR1,尚处试验阶段未被商业化[12]。
4 ES细胞的定向分化及其机制
目前所使用的诱导方法主要包括:外源性生长因子诱导ES细胞分化、转基因诱导ES细胞分化、ES细胞与其他细胞共培养的方式诱导ESC分化等[13]。
ES细胞可在体外诱导分化为神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、滋养层细胞、角化细胞、生殖细胞、内皮细胞、造血细胞、肺细胞和胰岛细胞等多种细胞类型[14]。
ES细胞的分化受内源性因素和外源性因素的共同调节。细胞内基因表达的调控作用是ES细胞发生分化的决定因素,细胞所在的环境条件对ES细胞的分化也有重要影响。
内源性调控:①基因因素。奢侈基因对细胞决定着细胞向特殊类型分化的物质基础,如编码肌细胞肌球蛋白基因,编码结缔组织的胶原蛋白基因等。②细胞蛋白的调控。细胞的结构蛋白如膜收缩蛋白和细胞周期素A、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)、分泌性蛋白质Nodal等都是对干细胞自我更新有着重要作用的细胞蛋白。③转录因子的调控。Oct-4和Nanog是两种维持干细胞多能性和自我更新的转录因子,分别与Sox 2、FoxD3等其他转录因子以及LIF、骨形态生成蛋白(BMP)等胞外信号通路互相作用,在特异时空激活或抑制靶基因的转录[2]。
外源性调控:①分泌因子。间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞的增殖、分化。特别是TGF-β家族和Wnt信号通路在不同组织中都发挥重要作用;②蛋白信号。有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。β-Catenin就是一种介导细胞黏附连接的结构成分,穿膜蛋白Notch及其配体Delta或Jagged也对干细胞分化有重要影响,变异的组蛋白H2AZ在染色质功能的发育过程中是一个关键的调控因子,对基因表达等功能起重要的作用。③细胞外物质的介导作用。细胞外起介导作用的物质包括细胞外基质、黏附分子、激素和细胞因子等[2]。
5 ESC的应用
ES细胞及其体外分化模型能够模拟胚胎正常发育进程,在发育生物学、转基因动物的生产、克隆动物、动物和人类疾病模型的建立、药物的开发和筛选、基因治疗、细胞组织和器官的修复和移植治疗等方面都有广泛的应用前景。
5.1 研究胚胎发育及疾病的发生
许丹等证明用ES细胞培养体系对小鼠的早期胚胎进行培养,可以显著提高小鼠早期胚胎的发育率[15]。还可以通过胚胎干细胞建立体外分化模型,并建立各种基因改变的胚胎干细胞系,以求发现某些基因或细胞因子在胚胎发育早期对不同类型细胞或组织分化的作用。hES细胞可用于研究人胚的早期发育,因为早期人胚发育过程尚不明了,能导致先天性缺陷和胎盘异常而导致流产的事件。研究体外hES细胞,可以鉴定引致这些问题的遗传学、分子生物学和细胞学事件,并确定如何预防其发生。hES细胞也可用于探索胚胎早期发育中染色体的异常,包括检测早期儿童肿瘤的发生[16]。
5.2 用于细胞、组织的修复和移植治疗
ES细胞最诱人的前景和用途是生产组织和细胞,因为它具有发育分化成构成机体的所有类型组织细胞的能力,任何因物理、化学或生物因素等造成的细胞损伤或病变引起的疾病都可以通过移植由ES细胞定向分化而来的特异组织细胞或器官来治疗[2]。并且,通过控制胚胎干细胞生长环境、向胚胎干细胞转染某一种系细胞形成的决定基因等,可获得数量不受限制的特定种系的较纯化的细胞,为细胞移植提供源源不尽的无免疫性的材料。如果这些细胞用于移植治疗,将给帕金森氏病、脊髓损伤、糖尿病、心肌损伤、肝硬化、肾衰竭、各种血液疾病等疑难病症的治疗带来新的希望[7]。
5.3 用于基因治疗
通过将人胚胎干细胞定向诱导分化成所需的细胞、组织、器官,不仅解决了移植材料来源困难问题,又可以对干细胞的基因做某些修改,即破坏细胞中表达组织相容性复合物的基因,以躲避受者免疫系统的监视,从而防止免疫排斥反应的发生。另一种克服移植免疫排斥反应的设想是结合克隆技术创建患者特异性的干细胞,用这种干细胞培养获得的细胞、组织或器官,其基因和细胞膜表面的主要组织相容性复合体与患者的完全一致,不会导致免疫排斥反应。另外,利用基因打靶技术使外源性DNA与胚胎干细胞中的相应部分重组,或靶向破坏等位基因造成基因纯合失效来治疗某些遗传性疾病,具有基因转移效率高、易于操作的优点。hES细胞可作为开发遗传工程的一种新方法。当前小鼠ES细胞的体外遗传互补极易通过同源重组技术实现,这是一种替换或添加基因的技术,它需要人为地将一个DNA分子导入基因组并表达它。利用这一方法,诱导分化成特定类型细胞的基因或表达所需蛋白产物的基因可以被导入ES细胞。如果利用人ES细胞使这一技术得以开发,则可设计出基因治疗的好方法[18]。
5.4 用于药物筛选和药物开发
新药在临床使用前需要进行一系列的检测和实验,这些实验都依靠动物来完成,但是动物模型实验不可能完全反映药物对人体细胞的作用。胚胎干细胞能模拟体内细胞或组织对被检测药物的反应,使结果更接近真实情况,从而提供更安全、更有效、更经济的药物筛选模型。于洲等对建立的胚胎干细胞神经发育毒性评价模型的研究证明,其可以作为体外发育毒性评价方法对神经发育毒物进行筛选。此外,由于ES细胞类似于早期胚胎组织,它还可用来揭示哪些药物会干扰胎儿的发育,引起出生缺陷。并且还可利用人胚胎干细胞建立人类疾病模型,在分子水平上研究疾病的发生机制,帮助寻找更有效的治疗方法和药物[19]。
6 目前存在的问题及展望
在ES细胞的研究中,仍然存在着许多问题,如诱导分化效率低、定向细胞分离和纯化困难、培养条件滞后、定向分化的机制、临床应用与转基因的安全性、交叉污染、免疫排斥等。除这些外,由于ESC涉及早期胚胎,因此由涉及的伦理、社会、法律、医学、神学和道德等争议也限制了当前hES细胞的发展,不得不引起重视[20]。
近年来的研究显示,体细胞在四个转录因子Oct-4、Klf-4、Sox-2和c-Myc的作用下可以重编程为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)。由于人iPSC可以较容易地由个体自身的体细胞经诱导获得,同时避免伦理方面的问题,因此,iPSC被认为是替代ESC的良好材料。为了提高iPS细胞技术的效率及安全性,研究围绕着筛选标记、载体系统、转导基因的种类、体细胞类型和一些可以促进效率提高的化合物筛选等展开,目前进展很快。
但是,iPS细胞也存在许多谜团,如iPS细胞其体细胞特异的基因是否完全沉默、重编程的结果差异和危险性等[21]。希望随着科技的发展,科学家们能陆续解答这些谜团,让ESC和iPS更好的造福于人类。
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1673-2995(2014)01-0062-05
吉林省科技发展计划项目基础研究自然科学基金项目(课题号:20130101147JC);吉林省2013年大学生创新创业训练计划项目.
曾 香(1990-),女(汉族),在读本科.
金玉姬(1965-),女(朝鲜族),教授,博士.
R329
A
2013-11-21)