microRNA在肝脏非可控病毒感染性炎性反应恶性转化过程中的作用

范瑞琦，揭克敏，肖影群，刘卓琦，王蒙蒙，罗达亚*

(南昌大学 1.基础医学院 生物化学与分子生物学教研室， 江西 南昌 330006；2.附属感染病医院 病理科， 江西 南昌 330002)

短篇综述

microRNA在肝脏非可控病毒感染性炎性反应恶性转化过程中的作用

范瑞琦1，揭克敏1，肖影群2，刘卓琦1，王蒙蒙1，罗达亚1*

(南昌大学 1.基础医学院 生物化学与分子生物学教研室， 江西 南昌 330006；2.附属感染病医院 病理科， 江西 南昌 330002)

非可控性炎性反应是指机体在感染或非感染因素的作用下，炎性反应无法从组织损伤模式转变至平衡稳定，而导致炎性反应持续进行的状态。miRNA与多种炎性因子相互作用，在肝脏非可控病毒感染性炎性反应恶性转化过程中发挥了重要的调控作用。深入研究miRNA与炎性因子在该过程中的作用将有助于揭示炎性反应与肿瘤的关系，为临床治疗非可控性炎性反应恶性转化类疾病提供新的思路。

非可控性炎性反应；microRNA；慢性病毒性肝炎；肝纤维化；肝细胞癌

炎性反应与肿瘤有着密切的关系，肿瘤又被称为“永不痊愈的创伤”，其中非可控性炎性反应(non-resolving inflammation)与肿瘤的发生有着更为密切的联系。机体在不确定因素的作用下，靶组织处于长期或过度反应时，炎性反应无法从抗感染、组织损伤模式下转变成平衡稳定的状态，而导致非可控性炎性反应的持续进行[1]。肿瘤中约15%～20%是由慢性感染引起的，而非可控性炎性反应是慢性感染过程中重要的病理生理变化。现有研究表明，慢性肠炎、前列腺炎、胰腺炎、幽门螺杆菌感染引起的慢性胃炎以及病毒感染引起的慢性肝炎分别与直肠癌、前列腺癌、 胰腺癌、 胃癌、 肝细胞癌紧密相关[2- 3]。以肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)为例，作为肝脏非可控性炎性反应的主要致病原，肝炎病毒感染人体后如果得不到及时清除则会导致肝脏长期处于抗感染状态，促使肝脏非可控性炎性反应病变迁延甚至恶性转化，以致肝纤维化、肝细胞癌的发生。

miRNA是继siRNA以后新发现的一类由19～26个核苷酸组成的内源性非编码小RNA。miRNA的调控具有微效、弥散的特征，主要通过其5′端的第2～8个核苷酸“种子序列”寻找并作用于mRNA的3′端非翻译区(Untranslated region，UTR)，从而下调基因的表达。研究显示，miRNA与炎性因子相互作用，在肝脏非可控病毒感染性炎性反应致肝细胞癌的发生过程中发挥了重要的调控作用。深入研究miRNA与炎性因子在该过程中的作用将有助于揭示炎性反应与肿瘤的关系，为临床治疗非可控性炎性反应恶性转化类疾病提供新的思路。

1 miRNA与慢性乙型病毒性肝炎

慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus，HBV)感染引起的威胁我国国民健康的主要传染病之一，全世界范围内约有3.5～4亿人口慢性感染乙型肝炎病毒。对参与CHB病理生理变化过程的miRNA进行监测，为及早发现、治疗HBV感染，预防疾病恶性转化提供了帮助。

在HepG2与HBV病毒致病基因重组的HepG2.2.15细胞中，存在24个高度差异表达的miRNA。在IFN-α分别作用两种细胞12 h后，HepG2细胞中23个miRNA存在差异表达，而HepG2.2.15细胞中只有5个差异表达的miRNA[4]。328个针对miRNA的反义寡核苷酸转染HepG2.2.15细胞，发现miR-199-3p与miR-210可以通过抑制病毒的复制减少HBsAg的表达，两者是分别通过作用于HBsAg的编码区域及前S1基因而发挥作用的[5]。以上研究说明，HBV的感染不仅通过改变miRNA的表达，反馈影响到HBV的胞内复制，而且这种变化的miRNA谱直接干扰了细胞对IFN-α的敏感性，这为临床诊断与药物治疗提供了借鉴。

miR-122是肝脏特异性的miRNA，占肝脏表达miRNA总量的70%。与正常人相比，CHB患者肝脏内miR-122的表达水平明显下调，并且其表达量与肝内病毒载量和肝脏坏死性炎性反应成负相关[6]；导入miR-122的表达载体或者其类似物后，病毒的复制得以抑制。纵观miR-122的研究报道，发现miR-122不仅可能通过靶向病毒基因组中的聚合酶基因的编码区域与核心蛋白基因的3′-UTR而抑制HBV病毒的复制与基因表达，而且，在炎性反应刺激过程中，IFN-α及其诱导活化蛋白NT5C3、PPARγ与RXRα复合体都可能通过转录或转录后机制调控miR-122的表达，影响CHB的病程发展[7-8]。

目前，肝脏病变损伤程度主要是依据患者血液中氨基转移酶的水平以间接判断。因体内其他炎性反应同样可以导致转氨酶水平的上升，故该检测手段的特异性不够强。研究证实，miR-146a可以通过靶向下调STAT1的活性而减弱抗病毒细胞因子的释放以及CD4+和CD8+T细胞发挥的细胞毒作用，且CHB患者T细胞的miR-146a明显升高，与血清中谷丙转氨酶水平呈现正相关[9]。可以期待，miR-122或miR-146作为灵敏反映肝炎病程的指标，辅助诊断CHB而应用于临床。

2 miRNA与慢性丙型病毒性肝炎

全世界范围内有大约1.7亿人罹患慢性丙型病毒性肝炎(chronic hepatitis C，CHC)。当丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染人体后，55%～85%的感染者不能清除病毒而演变为慢性感染，造成肝脏的长期损伤，10%～20%的患者会在20～30年后发展成为肝纤维化，1%～7%的患者最终会发展成为肝细胞癌[10]。

miR-155是联系炎性反应与肿瘤发生的重要中介。体外实验证实，在HCV感染过程中，NF-κB信号系统以及炎性反应相关的Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)和Toll样受体8(Toll like receptor 8，TLR8)配体与重组HCV核心蛋白NS3、NS5均可以诱导miR-155的表达升高[11]。miR-155通过抑制Wnt信号通路的负性调控因子大肠腺瘤样息肉(adenomatous polyosis coli，APC)基因而活化Wnt信号通路。未被降解的β-catenin转移入核激活细胞周期调控基因cyclin-D1、c-myc以及凋亡抑制基因survivin的转录，促进HCV感染细胞的增殖，并抑制其凋亡[12]。

作为肝脏中表达量最为丰富的miRNA，miR-122与HCV感染之间的关系研究也有较多报道。然而，与CHB不同的是，在HCV感染过程中，miR-122表达升高。作为最早发现的与HCV病毒复制有关的miRNA，miR-122可通过与HCV RNA的5′-UTR区域结合，上调HCV的复制水平[13]。大猩猩的体内实验证实，利用锁核酸修饰的硫代磷酸化寡核苷酸——SPC3649，可以通过特异性结合miR-122的5′端区域而抑制HCV病毒的复制，产生长效的低HCV病毒血症，并改善HCV诱导的肝脏病理损害[14]。由于在使用过程中并未发现明显的副作用，因此，SPC3649具有治疗CHC的潜在价值。

同样，miRNA在早期诊断丙型病毒性肝炎中的作用也正在逐步被大家所认同。研究发现，通过比较丙型病毒性肝炎未抗病毒治疗与抗病毒治疗有效的两组患者的外周血miRNA，发现miR-125b、miR-146a和miR-155在未抗病毒治疗组中均明显升高，且miR-155的血清水平与丙氨酸氨基转移酶或天冬氨酸氨基转移酶呈现正相关[11]。另一在临床患者中开展的血清学检测证实，miR-122与miR-34a在慢性丙型肝炎病毒感染过程中表达上升，且与血清酶学检测、肝脏纤维化程度与炎性反应活动明显正相关[15]。为此，miR-155、miR-122与miR-34a有望作为特异的非损伤性标志物应用于临床丙型病毒性肝炎的检测。

3 miRNA与肝纤维化

肝脏非可控病毒感染性炎性反应可造成肝脏的持续性损伤，由此引起肝脏对其损伤的动态修复。在这一过程中，肝内结缔组织出现异常增生、弥散性细胞外基质过度沉淀，久而久之导致肝纤维化的发生。肝纤维化发生的主要驱动因素是肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化。在HBV编码X蛋白、HCV非结构蛋白、基质金属蛋白酶-9、血小板源性生长因子或转化生长因子-β等因素的作用下，HSC活化、迁移并转分化为成纤维样细胞，释放细胞因子、趋化因子、生长因子与多种细胞外基质，促进了肝纤维化的发生与发展[16]。在此过程中，也伴随着miRNA与多种炎性因子的变化。

将大鼠肝脏中的HSC分选后体外培养，对未活化(2 d)、部分活化(7 d)和完全活化(14 d)的HSC进行miRNA芯片分析发现，与未活化HSC相比，部分活化与完全活化的HSC中17个miRNA表达上调，14个miRNA表达下调[17]。以HCV感染诱导肝纤维化的22位患者的肝组织进行miRNA芯片分析发现，与轻度肝纤维化组相比，重度肝纤维化组中18个miRNA表达上调，6个miRNA表达下调[18]。对比两组芯片数据，发现在HSC活化致肝纤维化过程中，miR-145、miR-199a-5p、miR-199a-3p、miR-214和miR-222表达均上调。

正常肝细胞中miR-29可负向调节细胞外胶原蛋白的含量。处于纤维化病变过程的肝细胞内miR-29表达下调，致使其调控靶点——血小板源性生长因子-C和胰岛素样生长因子-1表达上升，致Ⅰ型与Ⅳ型胶原蛋白合成增加，导致细胞外基质积累，使肝脏向纤维化的方向发展。该过程可分别被TGF-β和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)正向和负向调控[19- 20]。同样，在活化的HSC中，miR-17-92家族成员(miR-19a、19b和92a)的表达量明显下调，其中miR-19b的表达量的改变最大。miR-19b可以结合在炎性反应相关的TGFβRⅡ的3′-UTR处从而起到负性调节作用，使活化的HSC重新钝化[21]。为此，通过导入miR-29或miR-19b的类似物有望逆转非可控性炎性反应诱导肝纤维化的发生。

4 miRNA与肝细胞癌

肝脏的恶性肿瘤中80%为肝细胞癌。在全世界范围内，肝细胞癌已经成为发病率第5和死亡率第3的恶性疾病。肝细胞癌在诊断时多数已属晚期，失去了手术切除或肝脏移植的机会，即使少部分病例获得手术切除的机会，接踵而来的肝细胞癌复发与转移也使得术后5年生存率低于40%。

作为调控炎性反应与肿瘤过程的共有通道，NF-κB信号通路在非可控性炎性反应恶性转化研究中获得了更多的关注。通过构建NF-κB信号通路中重要炎性因子的荧光素酶报告基因系统，科研人员从870个miRNA中筛选出29个可能调控NF-κB信号通路的miRNA，其中包括miR-146a、miR-29、miR-155以及miR-195。与正常肝组织相比，miR-195在肝细胞癌中明显下调，且其表达与肿瘤的直径大小呈反比关系。体外与体内研究发现，miR-195能通过转录后调控NF-κB中的炎性反应信号因子——IκBK-α和TAB3，抑制细胞的增殖、迁移与肿瘤形成能力[22]。另有研究发现，白三烯-α、肿瘤坏死因子-α可通过与miR-224的启动子区结合而转录激活miR-224的表达，致使其靶点API5表达下调而抑制凋亡。该过程可被NF-κB增强，而特异性miR-224的抑制剂可阻断该过程并抑制细胞的迁移与侵袭[23]。

在肝脏非可控性炎性反应恶性转化的微环境中，活性氧、活性氮自由基等炎性介质不断产生，诱导DNA氧化损伤并促进了肝细胞癌的发生。在对29例肝细胞癌、22例慢性肝炎及10例胆囊切除术腹腔镜检肝组织的检测中发现，miR-199a、miR-195、miR-122、miR-92a与miR-222在不同分组中差异表达；氧化性DNA损伤的分子标志——8-羟基鸟苷的含量在肝细胞癌患者的癌组织与癌旁组织中明显升高，且与miR-92a的表达呈正相关[24]。以上结果说明，miRNA的差异表达可能参与了活性氧介导的DNA氧化损伤并诱导了肝细胞癌的发生。

5 小结与展望

非可控性炎性反应恶性转化的研究，将“炎性反应”与“肿瘤”两个系统融合为一，以“炎性肿瘤”系统以重新认识。该系统的诱导因素、演变规律、调控模式及其与其他系统之间的关系等均将为该领域的研究注入新鲜活力。另一方面，该领域的研究突破传统，将炎性反应更多地通过另一种视角——作为促癌因素被探讨，为探索炎性反应与肿瘤之间的关系开辟了新的热点。研究发现，在肿瘤发生的早期，肿瘤细胞可以通过改变分子表面标志“模糊”特异性识别，下调免疫攻击，并可能诱导免疫逃逸，以适应“杀伤性”炎性反应微环境；在肿瘤发生的晚期，肿瘤实质细胞可以发挥类似炎性反应间质细胞的作用，分泌多种促炎因子[25]，以稳定“维持性”炎性反应微环境而促进肿瘤的生长、血管生成、侵袭与转移。在此“互生互助”的过程中，miRNA发挥了重要的调控作用。例如，HBV感染可以通过上调TGF-β的表达而抑制miR-34a的作用，造成miR-34a的调控靶点CCL12表达上调。CCL12可以通过与调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)的表面分子CCR4特异性结合而募集Treg细胞，在局部炎性反应微环境中诱导对肿瘤实质细胞的免疫逃逸，并促进肿瘤实质细胞的转移与门静脉血栓形成等恶性表型的发生[26]。

作为非可控性炎性反应恶性转化调控中的重要环节，miRNA调控网络的研究仍然有待深入，这包括以下几点：1)更系统、全面、可靠并专一的“炎性肿瘤”相关miRNA网络调控数据库的建立；2)“炎性肿瘤”启动、进展及转移等过程中miRNA调控网络的变化规律；3)miRNA调控网络中多种miRNA之间相互作用的研究；4)“炎性肿瘤”相关miRNA的遗传学与表观遗传学调控机制；5)“炎性肿瘤”相关miRNA结合蛋白的鉴定及其功能研究；6)运用于临床诊断与治疗的“炎性肿瘤”相关miRNA分子标志物的筛选与鉴定。

综上所述，肝脏非可控性炎性反应诱导肝细胞癌的发生是一个复杂的、多基因参与调节的过程，miRNA在该过程中扮演着重要角色。随着对miRNA及其在肝脏非可控性炎性反应恶性转化的深入机制研究，人们对肝脏疾病的认识将更加全面，由此指导和产生的新的诊断技术和治疗方法，也将为肝病治疗提供帮助。

[1] Mantovani A, Allavena P, Sica A,etal. Cancer-related inflammation[J]. Nature, 2008, 454:436- 444.

[2] Mantovani A. Cancer: Inflaming metastasis[J]. Nature, 2009, 457:36- 37.

[3] El-Serag HB, Rudolph KL. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis[J]. Gastroenterology, 2007, 132:2557- 2576.

[4] Pan XB, Ma H, Jin Q,etal. Characterization of microRNA expression profiles associated with hepatitis B virus replication and clearanceinvivoandinvitro[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2012, 27:805- 812.

[5] Zhang GL, Li YX, Zheng SQ,etal. Suppression of hepatitis B virus replication by microRNA-199a-3p and microRNA-210[J]. Antiviral Res, 2010, 88:169- 175.

[6] Wang S, Qiu L, Yan X,etal. Loss of microRNA 122 expression in patients with hepatitis B enhances hepatitis B virus replication through cyclin G(1)-modulated P53 activity[J]. Hepatology, 2012, 55:730- 741.

[7] Hao J, Jin W, Li X,etal. Inhibition of alpha interferon (IFN-alpha)-induced microRNA-122 negatively affects the anti-hepatitis B virus efficiency of IFN-alpha[J]. J Virol, 2013, 87:137- 147.

[8] Song K, Han C, Zhang J,etal. Epigenetic regulation of MicroRNA-122 by peroxisome proliferator activated receptor-gamma and hepatitis b virus X protein in hepatocellular carcinoma cells[J]. Hepatology, 2013, 58:1681- 1692.

[9] Wang S, Zhang X, Ju Y,etal. MicroRNA-146a feedback suppresses T cell immune function by targeting Stat1 in patients with chronic hepatitis B[J]. J Immunol, 2013, 191:293- 301.

[10] Sarbah SA, Younossi ZM. Hepatitis C: an update on the silent epidemic[J]. J Clin Gastroenterol, 2000, 30:125- 143.

[11] Bala S, Tilahun Y, Taha O,etal. Increased microRNA-155 expression in the serum and peripheral monocytes in chronic HCV infection[J]. J Transl Med, 2012, 10:151- 160.

[12] Zhang Y, Wei W, Cheng N,etal. Hepatitis C virus-induced up-regulation of microRNA-155 promotes hepatocarcinogenesis by activating Wnt signaling[J]. Hepatology, 2012, 56:1631- 1640.

[13] Jopling CL, Yi M, Lancaster AM,etal. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific MicroRNA[J]. Science, 2005, 309:1577- 1581.

[14] Lanford RE, Hildebrandt-Eriksen ES, Petri A,etal. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection[J]. Science, 2010, 327:198- 201.

[15] Cermelli S, Ruggieri A, Marrero JA,etal. Circulating microRNAs in patients with chronic hepatitis C and non-alcoholic fatty liver disease[J]. PLoS One, 2011, 6:e23937.doi:10.1371/journal.pone.0023937.

[16] Leonardi GC, Candido S, Cervello M,etal. The tumor microenvironment in hepatocellular carcinoma (review)[J]. Int J Oncol, 2012, 40:1733- 1747.

[17] Chen C, Wu CQ, Zhang ZQ,etal. Loss of expression of miR-335 is implicated in hepatic stellate cell migration and activation[J]. Exp Cell Res, 2011, 317:1714- 1725.

[18] Ogawa T, Enomoto M, Fujii H,etal. MicroRNA-221/222 upregulation indicates the activation of stellate cells and the progression of liver fibrosis[J]. Gut, 2012, 61:1600- 1609.

[19] Kwiecinski M, Elfimova N, Noetel A,etal. Expression of platelet-derived growth factor-C and insulin-like growth factor I in hepatic stellate cells is inhibited by miR-29[J]. Lab Invest, 2012, 92:978- 987.

[20] Kwiecinski M, Noetel A, Elfimova N,etal. Hepatocyte growth factor (HGF) inhibits collagen I and IV synthesis in hepatic stellate cells by miRNA-29 induction[J]. PLoS One, 2011, 6:e24568.doi:10.1371/journal.pone.0024568.

[21] Lakner AM, Steuerwald NM, Walling TL,etal. Inhibitory effects of microRNA 19b in hepatic stellate cell-mediated fibrogenesis[J]. Hepatology, 2012, 56:300- 310.

[22] Ding J, Huang S, Wang Y,etal. Genome-wide screening reveals that miR-195 targets the TNF-alpha/NF-kappaB pathway by down-regulating IkappaB kinase alpha and TAB3 in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2013, 58:654- 666.

[23] Scisciani C, Vossio S, Guerrieri F,etal. Transcriptional regulation of miR-224 upregulated in human HCCs by NFkappaB inflammatory pathways[J]. J Hepatol, 2012, 56:855- 861.

[24] Romilda C, Marika P, Alessandro S,etal. Oxidative DNA damage correlates with cell immortalization and mir-92 expression in hepatocellular carcinoma[J]. BMC Cancer, 2012, 12:177- 185.

[25] Sgambato A, Cittadini A. Inflammation and cancer: a multifaceted link[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2010, 14:263- 268.

[26] Yang P, Li QJ, Feng Y,etal. TGF-beta-miR-34a-CCL22 signaling-induced Treg cell recruitment promotes venous metastases of HBV-positive hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Cell, 2012, 22:291- 303.

The role of microRNA in virus-infectionnon-resolving inflammation related hepatocellular malignant transformation

FAN Rui-qi1, JIE Ke-min1, XIAO Ying-qun2, LIU Zhuo-qi1, WANG Meng-meng1, LUO Da-ya1*

(1.Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Nanchang University, Nanchang 330006;2.Dept. of Pathology, Affiliated Infectious Diseases Hospital, Nanchang University, Nanchang 330002, China)

Non-resolving inflammation refers to a long-term non-homeostasis status under the action of infectious or non-infectious factors. There are studies showing that miRNA interacts with inflammation factors playing critical roles in the process of non-resolving inflammation related hepatocellular malignancy. Further investigation on the relationship between miRNA and inflammation factors during this process will be of great value to uncover the relationship between inflammation and tumor and innovate new therapy methods for non-resolving inflammation related malignant diseases.

non-resolving inflammation; microRNA; chronic viral hepatitis; liver fibrosis; hepatocellular carcinoma

2013- 05- 27

2013- 11- 21

国家自然科学基金(30860319，81160248，81360313)；江西省研究生创新专项资金(YC2013-S006)

*通信作者(correspondingauthor)： luodaya@hotmail.com

1001-6325(2014)08-1133-05

R 34

A