微量梯形板在Rh表型抗原自动化检测中的应用

王丽，连云，赵向东，李浩，朱阳泉

（镇江市中心血站输血研究室，江苏镇江212004）

微量梯形板在Rh表型抗原自动化检测中的应用

王丽，连云，赵向东，李浩，朱阳泉*

（镇江市中心血站输血研究室，江苏镇江212004）

目的：探讨微量梯形板在Rh表型抗原自动化检测中的应用效果。方法：在Xantus双机械臂加样仪及AK03B数字血型仪组成的全自动血型检测平台上，每批布局8块微量梯形板，每块微板检测24份血样。编制加样程序，优化相关检测参数，同时检测1 198份随机献血者血样及5份Rh（D）阴性固定献血者血样的Rh表型抗原（C、c、D、E、e）。结果：在被检血样红细胞稀释浓度为2%、5种检测试剂（IgM抗-C、c、D、E、e）分别稀释20倍（最终效价为1∶6．4）、室温静置反应时间为40 min等条件下，与试管法比较，1 203份血样Rh表型自动化检测结果符合率为100%。结论：微量梯形板用于Rh表型抗原检测可以实现自动化，适用于大批量标本检测。该方法具有快速准确、试剂耗量低、结果便于电脑统计管理等优点。

微量梯形板；Rh表型抗原；联合检测；自动化

Rh血型在临床输血及新生儿溶血病诊治中具有重要意义。Rh血型系统有5个重要抗原，即C、c、D、E、e，目前检测方法以手工试管法和卡式法为主，两者检测试剂成本较高，且速度慢，不适用于大批量标本。120孔微量梯形板是奥林巴斯公司研制的专用于血型试验的高科技产品，通过红细胞与相应抗体在微量梯形孔中的自然沉降反应，红细胞在抗体的桥联和自然重力作用下平铺于V型梯形孔的底部，形成相对均匀的红细胞层面；如果红细胞未与相应抗体结合，则在重力作用下滑落于梯型微孔底部中央形成一个致密的圆点。通过血型仪对微孔底部自动扫描成像，由判读程序对图像快速分析，准确得出结果，从而实现检测过程自动化。

1 材料和方法

1．1 标本来源

1 203份血样（其中有5份为应急招募的Rh阴性固定献血者血样）均来自镇江地区无偿献血者，每份血样容量为3～5 mL，EDTA-K2充分抗凝，检测前3 000×g离心6 min。

1．2 仪器与试剂

120孔微量梯形板（日本Olympus公司）、Xantus双机械臂全自动加样仪与AK03B数字血型仪组成的全自动血型检测平台（深圳爱康电子有限公司），红细胞稀释板（深圳爱康电子有限公司），单克隆IgM抗-C、抗-c、抗-E、抗-e试剂（英国Millipore公司），单克隆IgM抗-D试剂（加拿大Dominion公司）。

1．3 方法

1．3．1 布局检测平台 在Xantus双机械臂全自动血型检测平台上，布局8块120孔微量梯形板，每份标本5个Rh抗原的检测分别占用5个微孔，每块微板可检测24（120／5）份标本，每批最多可检测192（8×24）份标本。

1．3．2 编制检测程序 取一定量生理盐水＋被检血样压积红细胞于稀释板上充分混匀，得稀释被检红细胞，吸取125μL相应浓度红细胞于梯形微板的5个检测微孔中，每孔分配25μL；再分别吸取经预稀释的5种Rh血型试剂25μL于对应的5个孔中。设置后机械臂自动夹取微板在振荡器上中速混匀10 s，原位室温静置40 min。设置血型仪自动扫描判读：红细胞均匀分布在V型孔底的判为阳性，红细胞集中沉降于孔底中央的判为阴性。

1．3．3 优化相关检测参数 吸取生理盐水量分别为990、490、320μL，被检血样压积红细胞各10μL，得红细胞浓度分别为1%、2%和3%。用生理盐水对试剂原液进行10倍、20倍及30倍预稀释（原效价1∶128），稀释后效价分别为1∶12．8、1∶6．4及1∶4．3。每孔加入反应液的总量参考文献［1］，以充满微孔V型底部容积为宜。测量微孔V型底部的容积约为50μL，加被检稀释红细胞和预稀释试剂各25μL。

2 结果

2．1 微板底部扫描结果

经自然沉降反应后，不同反应结果微孔底部扫描图像见图1，抗体过量或反应时间过长、抗体不足等均可能造成假阴性结果。

2．2 被检血样表型结果

被检红细胞与5种抗体反应格局可得18种表型结果，1 203份献血者血样共检出12种表型，分布情况见表1，其中10例Rh阴性经确认试验均符合。

2．3 红细胞与抗体浓度的优化

不同浓度被检红细胞与不同效价抗体进行双盲试验，检测1 203份献血者血样Rh表型抗原。与试管法结果比较，当被检红细胞浓度为2%，试剂效价为1∶6．4时，5种表型结果符合率均为100%，见表2。

3 讨论

Rh血型系统是已知人类最具广泛多态性和产生免疫性的系统之一，其重要性仅次于ABO血型系统。Rh血型系统有45种不同的抗原，其中有5个抗原免疫原性较强，即D、E、c、C及e。根据红细胞上有无D抗原，将其分为Rh阳性和Rh阴性［2］。我国汉族人群Rh阴性比例极低，只占0．34%，因此临床上抗-D引起的溶血性输血反应和新生儿溶血病并不多见。近年来，随着临床用血量的增加，Rh系统的其他4个抗原引起的溶血性输血反应和新生儿溶血病屡见报道［3－4］。特别是E和c，在汉族人群中占有较高的频率［5］，因此临床上约有50%的输血为E和c的不合性输血。E和c的不合性输血，特别是多次或大量的输血，易导致患者产生抗-E和抗-c，如再次输血就可能产生严重的溶血性输血反应。孕妇产生抗-E和抗-c易造成胎儿或新生儿严重的溶血病［6］。因此，对于一些需反复输血的特殊患者和有生育能力的女性患者，Rh表型相合输血可以避免产生同种免疫性抗体。

目前Rh表型检测常用的方法有盐水试管法和微柱凝胶法。面对大量患者和献血者，同时检测5个抗原，这两种方法工作量大、操作烦琐且检测成本高，手工记录易出错。微量梯形板技术的运用，彻底解决了手工法检测血型的不足，微孔的底部根据红细胞直径设计了特有的阶梯形，每个阶梯的宽度与红细胞直径相当，便于桥联红细胞的平铺，没有抗体桥联的红细胞则滑落孔底。通过软件对微孔底部成像的快速分析判断得出准确的检测结果。因微量梯形板对结果的判断采用了特有的底部成像技术，因此轻中度的溶血和脂血标本对检测结果无影响。

微孔底部采用了V字型梯形结构，对于阳性反应孔，最佳的平面扫描图像中红细胞平铺于微孔底部；当红细胞浓度和反应体积一定时，最佳结果主要取决于反应液中抗体的效价。效价过高，红细胞将凝集成小块滑落孔底造成假阴性；效价过低，红细胞不能形成均一的桥联，则有部分红细胞沉于孔底，仍造成结果的假阴性。因此，要得到理想的检测结果，必须对试剂原液和被检红细胞用生理盐水作不同程度稀释后进行交叉试验。

由于本法有较高的灵敏度，微板的防污染不可轻视，一般采用配制清洁液浸泡过夜，加样仪使用一次性加样针可避免污染问题。

［1］ 彭小华，何婧婷，李丽平．120孔梯形微板法血型自动检测技术的应用［J］．实验与检验医学，2011，29（4）：377－378．

［2］ 高峰．临床输血与检验［M］．2版．北京：人民卫生出版社，2008：70－72．

［3］ 刘开良，李宁，李碧娟，等．患者红细胞不规则同种抗体分析与临床意义的探讨［J］．中国输血杂志，2011，24（9）：787－789．

［4］ 杨世明，张勇萍，安宁，等．新生儿溶血病红细胞血型免疫性抗体的特异性分析［J］．细胞与分子免疫学杂志，2011，27（10）：1130－1131．

［5］ 王玲．部分人群中Rh血型C、E抗原分布及意义［J］．临床检验杂志，2010，28（5）：371．

［6］ 岳晓红．IgG类抗-E致新生儿溶血病4例分析［J］．临床检验杂志，2010，28（3）：209－214．

R457．11

B

1671－7783（2014）06－0520－02

10．13312／j．issn．1671-7783．y140191

镇江市社会发展计划项目（SH2013098）

*：通讯作者，E-mail：yangquanzhu＠aliyun．com

2014－07－08 ［编辑］ 何承志