miRNA-34甲基化与卵巢癌临床病理特征及预后的关系

邵佳，何爱琴*，张玉泉，刘继斌

（1．南通大学附属肿瘤医院妇科，江苏南通226361；2．南通大学附属医院妇科，江苏南通226001；3．南通大学附属肿瘤医院研究所，江苏南通226361）

miRNA-34甲基化与卵巢癌临床病理特征及预后的关系

邵佳1，何爱琴1*，张玉泉2，刘继斌3

（1．南通大学附属肿瘤医院妇科，江苏南通226361；2．南通大学附属医院妇科，江苏南通226001；3．南通大学附属肿瘤医院研究所，江苏南通226361）

目的：探讨miR-34a和miR-34b／c基因启动子区甲基化水平与卵巢癌临床病理特征的关系。方法：采用特异性甲基化PCR分别检测80例卵巢癌患者卵巢癌组织及血浆中的miR-34a和miR-34b／c基因甲基化水平，分析其表达与临床病理特征及预后之间的关系。结果：80例卵巢癌组织中有58例miRNA-34a甲基化阳性，血浆阳性31例；有69例miRNA-34b／c基因甲基化阳性，血浆阳性40例。联合检测血浆和组织miRNA-34甲基化具有一致性。miRNA-34基因甲基化与FIGO分期、淋巴结转移有关（P＜0．05），与患者年龄、肿瘤有无包膜及病理类型无关（P＞0．05）。术后76例随访3年，有45例复发（59．21%），复发组癌组织和血浆miRNA-34甲基化阳性率分别为95．6%（43例）、62．2%（28例），明显高于无复发病例组［77．4%（24／31）和35．5%（11／31），P均＜0．05］；发生转移的36例患者癌组织和血浆miRNA-34甲基化率亦明显高于无转移组（40例）。结论：miRNA-34甲基化异常表达可作为晚期卵巢癌预后不佳的分子标志物。

卵巢癌；miRNA-34；甲基化；PCR

卵巢癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一，发病率占第3位，但是病死率却位于第1位，预后较差。因此，寻找一种新的特异性强的分子标志物，对提高卵巢癌患者的生存率具有较高的临床应用价值。目前认为，相关的miRNA在卵巢癌的发生、发展中起到了癌基因和抑癌基因的作用［1］。而miRNA基因甲基化可能是卵巢癌中miRNA异常表达的调控机制［2］。我们采用特异性甲基化PCR分别检测了卵巢癌组织及血浆中的miRNA-34a（miR-34a）和miR-34b／c基因甲基化状态，并分析了其表达与临床病理特征之间的关系。

1 对象与方法

1．1 病例

80例患者为2009年1月至2010年12月南通大学附属肿瘤医院妇科收治的卵巢癌病例，年龄≤60岁29例，＞60岁51例。其中，54例有淋巴结转移，38例肿瘤有包膜。参照FIGO（2009）分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期22例，Ⅲ期27例，Ⅳ期15例。手术方式：FIGOⅠ～Ⅱ期患者行全子宫＋双附件＋大网膜＋阑尾＋盆腔、腹主动脉旁淋巴结清扫。FIGOⅢ～Ⅳ期病例行肿瘤细胞减灭术（均行后腹膜淋巴结活检）。术后除了G1的ⅠA期和ⅠB期7例患者未补充化疗外，其余患者均行6～8个疗程的紫杉醇＋铂类化疗。术后均已随访和采集外周血、癌组织及癌旁组织；所有患者均签署知情同意书。

1．2 方法

1．2．1 主要仪器与试剂 Eppendorf系列PCR仪（德国），实时定量荧光PCR系统（上海索莱宝生物科技有限公司），Bio-Rad凝胶成像分析仪（美国伯乐公司），Eppendorf全自动移液器（上海心亮实业有限公司），酶标仪（北京市六一仪器厂），DNA测序仪（深圳山奇山生物技术有限公司），微电脑全自动控制雷射显微细胞组织撷取系统、CM3050S冰冻切片机（德国莱卡仪器有限公司），凝胶成像系统（北京市六一仪器厂），高速低温落地式离心机、台式离心机（北京时代北利离心机有限公司），超净工作台（广东上善尚德净化科技有限公司）。

1．2．2 组织和血浆DNA提取 采用人类组织和细胞DNA提取试剂盒（德国）提取组织和血浆DNA。患者均晨起空腹抽取外周静脉血（抗凝），组织标本在离体10min之内取材，液氮速冻5min后－80℃保存。

1．2．3 miRNA甲基化定量检测 应用EZDNA甲基化试剂盒（美国Zymo公司）进行DNA变性及重亚硫酸氢盐转化。根据测序的结果设计miRNA特异性引物和探针，应用实时PCR法检测miRNA甲基化水平。反应体系和条件参照试剂盒说明书进行，每个样品都进行3次平行实验，用Human CpGenome Universal Methylated DNA（Chemicon International，美国）作为阳性对照，双蒸水作为阴性对照。具体步骤：①实验前先将CT保存试剂混匀，将900 μL水、50μLM-溶解缓冲液以及300μL M-稀释缓冲液加入到同一试管中。②将130μL的CT保存试剂与上步提取的DNA样品20μL摇匀混合。③按照以下温度程序进行操作：98℃10 min，64℃ 2．5 h，最后4℃存储备用。④将660μL的M-链接缓冲液加入到Zymo-spin IC吸附柱，再加入样品，密闭后再颠倒混合数分钟。⑤10 000 r／min全速离心1min，去掉离心液。将20μL的M-去璜化缓冲液加入到吸附柱，再放置15～20 min。⑥10 000 r／min全速离心1 min。向吸附柱中加入200μL的M-漂洗缓冲液，多次重复此步骤。⑦直接加M-洗脱缓冲液10μL到吸附柱的基质，放置在1．5 mL试管中10 000 r／min离心2 min，分离出所需的DNA模板。miR-34甲基化引物序列见表1。

1．2．4 特异性甲基化PCR 甲基化PCR反应体系为2．5μL10×PCR缓冲液、2．0 mmol／L 4×dNTP混合物0．5μL、3μL引物、0．5μL的TaKaRaTM热启动Taq酶、25 mmol／L MgCl22μL以及模板3μL。甲基化扩增体系：95℃预变性12 min，随后94℃15 s，共40个循环；55℃30 s，72℃40 s，再72℃延伸10 min。非甲基化扩增体系的退火温度提升至56℃，其他步骤均相同。扩增产物为2%琼脂糖凝胶电泳，紫外光照射显带。RT-PCR：取1～2μL甲基化修饰型DNA进行PCR，扩增产物为2%琼脂糖凝胶电泳，然后紫外光照射显带。

1．2．5 随访 统一制订调查问卷和随访工作手册，所有资料均由专人编码，核查正确后双轨录入计算机。对全部病例每3个月随访1次，以是否复发、转移或因卵巢癌死亡作为观察终点。复发的评价指标是肿瘤病灶再次出现在原有位置，转移的评价指标是肿瘤病灶脱离其原发部位，扩散到身体其他部位。

1．3 统计学方法

应用EpiData 3．1中文版软件处理随访资料以及实验数据，使用SAS 9．0软件进行资料分析，组间比较运用χ2检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 卵巢癌患者血浆和组织中miR-34甲基化率

80例卵巢癌组织标本中检测出miR-34a基因甲基化阳性58例，而血浆中miR-34a基因甲基化阳性31例。80例卵巢癌组织中miR-34b／c基因甲基化阳性69例，血浆中miR-34b／c基因甲基化阳性40例。

80例卵巢癌组织中，miR-34基因甲基化阳性达71例，血浆中miR-34基因甲基化阳性41例。2%琼脂糖凝胶电泳显示，miR-34a和miR-34b／c基因成单一条带。

2．2 卵巢癌miR-34甲基化与临床病理特征的关系

我们对80例卵巢癌组织和血浆miR-34基因甲基化与患者年龄、肿瘤有无包膜、FIGO分期（2009）和病理类型的关系进行了分析。病理类型中，子宫内膜样癌22例，浆液性癌31例，黏液性癌27例。结果显示，miR-34基因甲基化率与FIGO分期相关（P＜0．05），有淋巴结转移组无论是卵巢癌组织中还是血浆中的miR-34基因甲基化率均明显高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义（P＜0．05）。同时发现miR-34基因甲基化与患者年龄、肿瘤有无包 膜及病理类型无关（P＞0．05）。见表2。

2．3 miR-34甲基化与卵巢癌复发转移的关系

80例患者中有76例（95．0%）术后随访3年，发现卵巢癌复发45例，其中癌组织miR-34甲基化阳性43例（95．6%），血浆miR-34甲基化阳性28例（62．2%）。而未复发的31例患者中，癌组织miR-34甲基化阳性24例（77．4%），血浆miR-34甲基化阳性11例（35．5%），复发组无论是癌组织还是血浆miR-34甲基化率均明显高于未复发组，差异均有统计学意义（χ2＝4．18和5．25，P均＜0．05）。

36例发生转移的病例中癌组织miR-34甲基化阳性35例（97．2%），40例未转移的病例中32例（80．0%）甲基化阳性，两者差异有统计学意义（χ2＝3．86，P＜0．05）。转移组血浆miR-34甲基化阳性24例（66．7%），亦明显高于未转移组（15例，37．5%），差异亦有统计学意义（χ2＝6．45，P＜0．05）。

3 讨论

近年来，miRNA作为一类新的癌基因和抑癌基因逐步受到重视。miRNA可能参与了人类所有的生理及病理活动的调控。miRNA的转录过程由RNA聚合酶Ⅱ介导，而DNA甲基化是一种重要的使RNA聚合酶Ⅱ转录的基因表达沉默的表观遗传方式，因此DNA甲基化调控miRNA的表达。目前较多研究认为，DNA甲基化在肿瘤的发生、发展及预后判断中发挥着重要作用。

微阵列芯片技术的应用使得组织中的miRNA表达谱检测成为可能，虽然miRNA表达的变化和不同组织类型肿瘤的生物学之间的功能性联系仍不是十分明朗，但miRNA的保守性及稳定性之高使其成为一种新的肿瘤标志物，具有较好的临床应用前景。卵巢癌中部分miRNA表达升高，部分表达下降，因而miRNA的表达谱可以鉴别正常卵巢组织与良性、恶性卵巢肿瘤［3］，同时还可以区分原发性与继发性卵巢癌［4］。在妇科恶性肿瘤中，卵巢癌的致死率无疑是最高的，研究也较为深入。目前认为相关的miRNA在卵巢癌的发生发展中起到了癌基因和抑癌基因的作用。通常miRNA的DNA甲基化可分为高甲基化以及低甲基化。高甲基化即正常组织中不会发生甲基化的位点被甲基化，低甲基化则是在正常组织发生甲基化的位点上出现去甲基化现象。Lujambio等［5］研究发现，某些肿瘤中miRNA的高甲基化可通过去甲基化剂降低甲基化水平，使miRNA的表达重新上调，这表明miRNA的表达情况明显受到了启动子区CpG岛甲基化的影响。Dahiya等［6］检测15例正常卵巢组织、69例卵巢恶性肿瘤组织，发现正常组织与肿瘤组织中89%的miRNA表达水平不同，其中miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141表达增高，miR-140、miR-199a、miR-145及miR-125b1表达明显下降。Iorio等［7］发现miR-21、miR-203以及miR-205在卵巢癌细胞中表达升高，而这三者正定位于DNA甲基化转移酶作用的CpG岛上。且这些miRNA在卵巢癌OVCAR3细胞株经5-Aza-CdR诱导后表达明显升高，故推测其表达上调是由于DNA甲基化不足引起的，提示miR-21、miR-203以及miR-205的异常表达受DNA甲基化的调控，其致癌基因作用参与卵巢癌的发生发展。Let-7a-3是Let-7家族中的一员，是最早发现的miRNA之一，定位于CpG岛。Kan等［8］发现Let-7a-3低甲基化引起胰岛素样生长因子Ⅱ表达异常，从而影响卵巢癌患者预后，而Let-7a-3高甲基化可明显降低卵巢癌患者死亡风险［9－10］。Corney等［11］研究表明，在上皮性卵巢癌中，miR-34a、miR-34b／c变化最明显，所有miR-34a的DNA甲基化样本miR-34a表达均下调。57%的miR-34b、miR-34c甲基化样本出现miR-34b、miR-34c的表达下调，用甲基化抑制剂处理后，miR-34a、miR-34b／c重新表达。2011年Vogt等［12］的研究结果与其基本相符，表明miR-34a、miR-34b／c的DNA甲基化与卵巢癌具有相关性。2012年Yang等［13］检测了26例卵巢癌组织及5例卵巢良性肿瘤组织的DNA甲基化水平。结果发现miR-130b卵巢癌组织甲基化表达水平明显高于良性卵巢肿瘤组织，且miR-130b在卵巢组织中的表达与其甲基化的水平显著负相关。细胞水平研究显示，耐药细胞株中的miR-130b甲基化水平远远高于亲本株。予去甲基化药物处理后，miR-130b的甲基化水平明显下降，其表达水平显著上升，从而推断miR-130b的表达受甲基化调控，去甲基化可部分逆转卵巢癌细胞耐药。上述研究表明miRNA的DNA甲基化具有一定的肿瘤特异性，与卵巢癌的发生发展密切相关。

此外，关于miRNA的DNA甲基化与其他恶性肿瘤之间的关系也有较多报道。Roman-Gomez等［14］的研究提示miRNA甲基化是急性淋巴细胞性白血病预后的独立预测因素。Hildebrandt等［15］研究发现，miR-9-1和miR-9-3在肾透明细胞癌组织中特异性超甲基化，且这两个基因的高甲基化水平可显著降低肾细胞癌患者的无复发生存期。

目前临床上较多采用的是将血清CA125作为卵巢癌病情的评价指标，但是CA125有一定的局限性，其特异性不强，在盆腔炎、卵巢巧克力囊肿等良性疾病中也会升高。因此，寻找一种新的特异性强的分子标志物很有必要。miRNA甲基化的研究目前还处于初级阶段，人们对miRNA调控机制的认识仍较浅显。本研究发现随访的76例卵巢癌患者中，miR-34甲基化与卵巢癌复发、转移有一定的关系，血浆中miR-34甲基化状态可用来监测卵巢癌病情的发展，并可指导临床治疗。但因本研究样本量有限，结论是否符合临床实际，仍需大样本量的临床验证以及长期的随访调查。

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R737．31

B

1671－7783（2014）06－0513－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140255

*：通讯作者，E-mail：8717717＠qq．com

2014－09－21 ［编辑］ 陈海林