一步法宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒DNA抽提方法的建立

赵琪

（南京医科大学附属无锡人民医院检验科，江苏无锡214023）

一步法宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒DNA抽提方法的建立

赵琪

（南京医科大学附属无锡人民医院检验科，江苏无锡214023）

目的：建立一步法抽提宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）DNA的方法。方法：收集200例宫颈脱落细胞标本，分别采用柱式法DNA提取试剂盒和一步法抽提HPV-DNA，用微量核酸测定仪测定DNA的纯度和浓度，采用PCR反向斑点杂交（PCR-RDB）法进行HPV-DNA分型检测。结果：柱式法抽提的DNA纯度和浓度分别为（1．91±0．14）μg／mL和（139．78±18．21）μg／mL，一步法抽提的DNA纯度和浓度分别为（1．86±0．19）μg／mL和（124．36±17．35）μg／mL，两种方法的DNA纯度和浓度差异均有统计学意义（P＜0．01）。柱式法和一步法HPV分型的总阳性率、单一感染率、多重感染率分别为17．5%（35／200）、7．5%（15／200）、10%（20／200）和17．5%（35／200）、8%（16／200）、9．5%（19／200），两法一致性检验Kappa值为0．886，结果具有较好的一致性。结论：一步法提取宫颈脱落细胞HPV-DNA步骤简单，DNA质量高，完全适用于临床样本的HPV分型检测。

聚合酶链反应；反向斑点杂交；人乳头瘤病毒；DNA提取；一步法；分离方法

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一种严格嗜上皮细胞的病毒，HPV感染与宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）有关，高危型别HPV是许多生殖道疾病或生殖道癌症的致病原因之一［1－2］。HPV分型检测作为临床预测患病风险、选择治疗方案和HPV疫苗开发研究的重要指标，日益受到重视。HPV-DNA提取方法的研究是对其基因型检测的基础和前提，提取的DNA质量也直接影响后续的实验操作。目前，HPV在临床上的应用除了受到分型方法繁琐和成本昂贵等因素限制之外，HPV-DNA提取过程过于复杂也限制临床上广泛使用。为了减少工作强度和提高DNA质量，建立一种操作简单，成本低廉，质量符合PCR扩增需要的HPV-DNA提取方法显得特别重要。本研究建立了一步法HPV-DNA提取法，并与柱式法DNA提取法相比较，现报告如下。

1 材料和方法

1．1 标本

收集200例2013年5月至12月来本院体检的女性宫颈脱落细胞标本，其中正常状态标本（不带血液和黏液、外观清亮）60例，带血标本（外观红色或红褐色）40例，带黏液标本（外观混浊、胶冻状）50例，带血带黏液标本（外观红色或红褐色、胶冻状）50例。每份样本混匀后平均分为2管，每管各吸取500μL宫颈液。根据随机分配原则，一管标本采用柱式法DNA提取试剂盒抽提HPV-DNA，另外一管则采用一步法进行HPV-DNA抽提。

1．2 主要仪器和试剂

Verriti96孔梯度PCR仪（美国ABI公司），Thermo台式微量离心机，NV3000C核酸测定仪（美国），Bioer恒温金属浴，亚能YN-H16杂交仪，TY-80R脱色摇床。

本研究所用引物和探针由上海英骏生物公司合成。多重PCR试剂盒购自Qiagen公司，柱式法DNA提取试剂盒、TMB购自上海生工生物工程有限公司，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素购自碧云天生物技术有限公司；A、B、C液和一步法HPVDNA提取液为本室自配，PCR反向斑点杂交（PCR reverse dot blot，PCR-RDB）法HPV分型试剂由本室研制。

1．3 方法

1．3．1 DNA提取 ①一步法HPV-DNA提取步骤：在含宫颈脱落细胞的1．5 mL离心管中加入1 mL双蒸水，剧烈振荡（3 000 r／min）10 min（正常状态标本可省略此步），13 000 r／min离心5 min，弃上清（带血样本重复1次）。在细胞沉淀中加入一步法HPV-DNA提取液100μL。充分混匀，100℃煮沸10 min。13 000 r／min离心5 min，上清备用。②柱式法提取HPV-DNA按说明书操作。分别取2μL两种方法提取的HPV-DNA用微量核酸测定仪测定DNA纯度和浓度。

1．3．2 PCR体系及扩增 将上下游引物稀释至100μmol／L后各取5μL混匀分别配成上下游混合引物。50μL多重PCR扩增体系中包含25μL Qiagen缓冲液，5μLQ-溶液，5μL染料，0．157 5μL的上游引物和0．362 5μL的下游引物，模板4μL，水10．48μL。95℃预变性10min；95℃30 s，50℃90 s，72℃30 s，共40个循环；68℃延伸10 min。

1．3．3 杂交 HPV PCR-RDB分型方法简述如下：取20μL PCR产物加入含8 mL A液的杂交管中，100℃变性10 min。放入杂交仪中51℃杂交2 h。取出膜条，放入预热至51℃装有B液的杂交管中，51℃摇洗5 min。取出膜条，放入用 A液1∶2 500稀释的HRP标记的链霉亲和素中，室温轻摇孵育30 min。A液室温洗涤2次，每次5 min。C液洗涤膜条2 min，避光显色3 min，蒸馏水终止反应。膜条相应位置出现肉眼可见的蓝色斑点判断为某型别HPV阳性，用β-球蛋白基因作为内控（IC）。

1．4 统计学处理

应用SPSS 21．0软件进行统计学分析，两组样本的DNA纯度、浓度进行配对t检验，阳性率比较采用χ2检验。一致性检验采用Kappa检验，Kappa值≥0．75表明两者一致性好，0．75＞Kappa值≥0．4表明一致性一般，Kappa值＜0．4表明两者一致性差。

2 结果

2．1 两种提取方法所得HPV-DNA的浓度

柱式法与一步法抽提的DNA纯度和浓度间的差异均有统计学意义（P＜0．01），见表1。

2．2 多重PCR扩增结果

取5μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，450 bp处出现条带为阳性，268 bp处出现条带为β-球蛋白基因（图1，只显示部分结果）。

2．3 两种HPV-DNA提取方法在HPV分型结果中的比较

200例临床标本HPV分型结果见表2，柱式法和一步法HPV分型的总阳性率、单一感染率、多重感染率分别为17．5%（35／200）、7．5%（15／200）、10%（20／200）和17．5%（35／200）、8%（16／200）、9．5%（19／200），两种方法在总阳性率、单一感染率和多重感染率方面无明显差异（χ2值分别为0，0．037和0．028，P值分别为1，0．847和0．866），两法一致性检验Kappa值为0．886（P＜0．01），结果具有良好的一致性。

3 讨论

临床HPV分型主要是基于PCR的分型法，是目前所有HPV-DNA分析技术中最敏感和方便的方法［3－4］。本研究采用的HPV方法是基于PCR的反向斑点杂交法。DNA提取是HPV检测的基础，提取纯度及浓度将直接影响基于PCR的HPV分型方法的准确性。D′Souza等［5］也指出，尽管是来源于同一组织的HPV标本，前处理方法的不同也会导致HPV分型的差异。HPV病毒主要存在于宫颈上皮细胞，临床上收集的标本往往混杂有脓性黏液或血液。本研究的目的是建立一种简单实用的方法，能从不同状态的宫颈脱落细胞标本中抽提出高质量的DNA，用于PCR基础的HPV分型检测，确保实验结果的准确可靠。

细胞基因组DNA提取方法有煮沸法、碱裂解法、SDS裂解法和蛋白酶K消化分离法等。煮沸法虽然操作方法简单，但细胞DNA收率较低，纯度不高，同时内源性抑制物不能有效清除，特别是带血标本。其他方法如碱裂解法、SDS裂解法和蛋白酶K消化分离法最后都需要饱和酚／氯仿的抽提过程，否则提取的DNA中的蛋白、EDTA和SDS等残留物质以及内源性抑制物都会对PCR产生抑制作用，而饱和酚／氯仿的抽提过程十分烦琐，大样本量的临床应用受到限制。

柱式法采用硅胶膜作为核酸的特异性吸附材料，提取基本原理为饱和酚／氯仿的抽提加上核酸特异性吸附和洗脱。柱式法提取的核酸完整、纯度高，提取的产物可直接用于PCR、RT-PCR及基因克隆等分子生物学实验研究及临床检测。但是柱式法提取基因组DNA成本较高，操作虽然有所简化但还是相当烦琐，临床应用仍然受到限制。

标本中的红细胞可通过血红素的卟啉环与Taq酶产生不可逆结合而抑制Taq酶的活性，导致PCR反应受到抑制［6］。而黏液标本中可能含有较多的黏蛋白、免疫球蛋白、蛋白酶和多糖等内源性PCR抑制物，这些物质可通过干扰核酸提取过程的细胞裂解或者通过抑制DNA聚合酶活性而干扰PCR反应［7］。因此本研究共收集200例各种成分的宫颈脱落细胞样本，包括正常状态标本、带血标本、带黏液标本和带血带黏液标本，观察一步法提取的DNA是否可以应用于HPV分型。结果表明，本文建立的一步法在DNA提取纯度和浓度方面与柱式法虽有明显差异，但是260 nm／280 nm的比值达到了1．7～1．9的DNA提取要求，浓度足够满足进一步实验需要。PCR结果也证实一步法提取的DNA对扩增无明显抑制，说明一步法提取的DNA中卟啉环以及一些内源性PCR抑制物的浓度在不影响PCR结果的安全浓度之内。分析其原因：①通过2次10 min的振荡弃上清过程，带血标本中的血红素卟啉环浓度大大降低，达到了临床可接受的使用浓度。②通过10 min振荡也使黏液标本中的多糖等内源性PCR抑制物大大减少。其他黏蛋白、免疫球蛋白和蛋白酶等蛋白类PCR抑制物则通过一步法提取液中的蛋白沉淀剂得到有效清除。

柱式法和一步法提取DNA后的HPV分型结果一致性检验Kappa值达到0．886，显示相关性良好，并且两种方法总阳性率的差异无统计学意义。两种方法的差异仅仅表现在1个标本上，一步法的分型结果显示是单重感染而柱式法显示的是双重感染。这进一步说明，一步法提取的DNA完全适合临床样本的HPV分型。

本研究建立的HPV-DNA一步提取法操作简单方便，全部操作时间：带血标本约45 min，带黏液标本约30 min，不带血液和黏液标本约20 min。这为大批量分析宫颈脱落细胞样品（特别是黏液型和血液型标本）的HPV分型，提供了一种简易的DNA提取手段。

总之，本研究建立的一步法提取宫颈细胞HPVDNA，效果类似于柱提法。并且一步法提取DNA有着不可代替的优点：①大大减少了DNA提取的工作量，适合大样本量的HPV分型检测。②减少污染机会。较柱式法多次抽提换管而言，一步法提取DNA的整个操作在1个Ependorf管中进行，减少了污染的概率。③降低了实验成本。

［1］ Chinchai T，Chansaenroj J，Swangvaree S，et al．Prevalence of human papillomavirus genotypes in cervical cancer［J］．Int JGynecol Cancer，2012，22（6）：1063－1068．

［2］ Baussano I，Elfström KM，Lazzarato F，et al．Type-specific human papillomavirus biological features：validated model-based estimates［J］．PLoS One，2013，8（11）：e81171．

［3］ Abudukadeer A，Ding Y，Niyazi M，et al．Distribution of HPV genotypes in uterine cervical lesions among the Uighur women in Xinjiang province of China［J］．Eur J Gynaecol Oncol，2010，31（3）：315－318．

［4］ Szostek S，Klimek M，Zawilinska B，et al．Genotypespecific human papillomavirus detection in cervical smears［J］．Acta Biochim Pol，2008，55（4）：687－692．

［5］ D′souza G，Sugar E，Ruby W，et al．Analysis of the effect of DNA purification on detection of human papillomavirus in oral rinse samples by PCR［J］．JClin Microbiol，2005，43（11）：5526－5535．

［6］ Higuchi R．PCR technology：principles and applications for DNA ampliofieation［M］．New York：Stockton Press，1989：31－38．

［7］ 李金明．实时荧光PCR技术［M］．北京：人民军医出版社，2007：70－71．

Establishment of the one-step DNA extraction method of human papillomavirus in cervical epithelium sam ples

ZHAO Qi
（Department of Clinical Laboratory，Wuxi People′s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Wuxi Jiangsu 214023，China）

Objective：To develop an one-step method on DNA extraction of human papillomavirus in cervical epithelium samples．M ethods：The extraction of HPV-DNA in 200 cases collected from cervical epithelium sampleswas treated by column method of DNA extraction kit or one-step method．DNA purity and concentration of the samples were measured by the trace nucleic acid spectrophotometer．HPV genotypeswere detected by PCR reverse dot blot（PCR-RDB）method．Results：DNA purity extracted by column method and one-step were（1．91±0．14）μg／mL and（1．86±0．19）μg／mL，respectively，and concentration of the HPV-DNA were（139．78±18．21）μg／mL and（124．36±17．35）μg／mL，respectively．DNA purity and concentration extracted by twomethodswere all not statistically significant（P＜0．01）．The rates of positive，single infection andmultiple infection of HPV genotyping treated by the columnmethod and one-step method were 17．5%（35／200），7．5%（15／200），10%（20／200）and 17．5%（35／200），8%（16／200），9．5%（19／200），respectively．The value of Kappa was0．886，which indicated that there was a high degree of consistency．Conclusion：The one-step method on HPV DNA extraction was simpler，the DNA quality was high and suitable for HPV DNA genotyping of the cervical epithelium samples．

polymerase chain reaction；reverse dot blot；human papillomavirus；DNA extraction；onestep method；separation method

Q781

A

1671－7783（2014）06－0491－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140261

赵琪（1971—），女，江苏无锡人，副主任技师，主要从事临床检验诊断学研究。

2014－10－08 ［编辑］何承志