辽东楤木体细胞组织培养研究*

张云风，徐睿智，樊娜，马琳

（天津中医药大学中药学院，天津 300193）

辽东楤木体细胞组织培养研究*

张云风，徐睿智，樊娜，马琳

（天津中医药大学中药学院，天津 300193）

通过查阅和整理国内外相关文献资料，简述了辽东楤木体细胞组织培养研究的现状与进展。目前辽东楤木可以通过两种途径获得再生苗,一条途径是胚状体成苗，另一条途径是分割丛生芽诱导生根成苗。而在辽东楤木体细胞胚和丛芽的诱导过程中，外植体、培养基、生长调节物质、培养条件（接种量、pH值、糖浓度、光照等）均为其关键因素。

辽东楤木；体细胞；组织培养；外植体

辽东楤木[Aralia elata（Miq．）Seem.]又称龙芽楤木，刺老鸦，为五加科楤木属植物灌木或小乔木。主要分布于辽宁、吉林、黑龙江、朝鲜、日本等地[1]。辽东楤木具有较高的药用和食用价值。它的根皮可入药，其中含有多种皂苷类成分,如齐墩果酸苷、罗盘草苷、竹节人参皂苷、屏边三七皂苷等，另外还含有生物碱、挥发油、香豆素、豆甾醇及β-谷甾醇等成分[2-4]。现代药理学研究发现其具有抗炎、镇静、利尿、强心、抗氧化、抗病毒、抗糖尿病并发症等作用[5-7]。它的嫩芽含有人体所需的多种氨基酸、维生素和大量的蛋白质、脂肪、糖，以及钙、磷、铁等多种微量元素，营养丰富，味道鲜美，是一种珍贵的药食蔬菜[8]。由于种子细小自然繁殖率低，再加上过度采挖，辽东楤木的野生资源正在迅速减少。现在生产上主要采用无性繁殖,用茎或根段扦插繁殖。由于辽东楤木分枝少,无性繁殖需采集大量的扦插材料,对野生资源破坏严重。为了满足市场对种苗的需求和积极保护野生植物资源,采用组织培养进行快速繁殖是保持辽东楤木优良性状,加快繁殖速度的有效途径[9]。本文对近几年辽东楤木植物组织培养的研究进展进行综述，以期为辽东楤木植物资源种苗规模化组培繁育提供参考。

1 愈伤组织和胚状体的诱导培养

1.1 基本培养基辽东楤木组织培养中以MS培养基最为常用，麦氏培养基（MA培养基）的应用也有报道。李福安等[10]研究了基本培养基对胚胎发生频率的影响，结果表明低盐、低铵离子（NH4+）浓度MA培养基易于诱导外植体形成愈伤组织；而高盐、高NH4+浓度的MS培养基有利于诱导体细胞胚的发生。

1.2 外植体和组织培养条件辽东楤木组织培养中采用的外植体以营养器官为主，主要包括幼叶、幼嫩叶柄、嫩茎、芽（顶芽、腋芽、休眠芽）。赵恒田等[11]以茎尖、幼叶、嫩茎、休眠芽为外植体，以MS+0.1mg/L萘乙酸（NAA）+2.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤、细胞分裂素（6-BA）诱导愈伤组织，结果以幼叶的出愈率最高，为90%，嫩茎、茎尖依次为86.6%、83.3%。李正楠等[12]利用辽东楤木叶片、叶柄、嫩茎及根为试材，以MS+（2，4-二氯苯氧基）乙酸（2，4-D）1.0 mg/L为培养基，发现均可不同程度地诱导出胚性愈伤组织，其中嫩茎诱导愈伤组织及胚状体最好。秦亚平等[9]对辽东楤木的叶片、叶柄、幼茎在MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D 1.5mg/L进行组织培养，结果表明：叶片的诱导效果最好，出愈率为37.1%。李建民等[13]发现在同一培养基［MA+0.5～3 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L细胞分裂素（BA）］上，茎较叶易于诱导愈伤组织，两者平均诱导率分别为77%、63.8%。

此外还有报道[14]，先以种胚在1/2 MS培养基中，使胚萌发成无菌种苗，再将其根部做为外植体接种到培养基［1/2 SH＋3.0 mg/L吲哚丁酸（IBA）＋0.2 mg/L激动素（KT）］中诱导胚性愈伤组织，并在同样条件下进行愈伤组织的增殖。

1.3 生长调节物质配比辽东楤木组织培养中应用的生长调节物质主要为生长素类［2，4-D，NAA，吲哚-3-乙酸（IAA），IBA］和细胞分裂素类（BA，6-BA）两大类。不同种类和浓度配比的生长调节物质对外植体的分化和成苗的影响很大。

韩建军[15]对野外采集的嫩芽进行组织培养，诱导愈伤组织的培养基为添加1.0 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L 6-BA的MS培养基，培养7 d左右，开始出现愈伤组织，30 d左右形成瘤状愈伤组织块。秦亚平等[9]在辽东楤木的组织培养的研究中发现，在MS培养基中加不同配比的2，4-D和6-BA，对愈伤组织的诱导率有很大影响，诱导率随着2，4-D浓度的增加而增加，但浓度到1.5 mg/L时诱导率开始下降；在适当增加2，4-D浓度的同时，加入少量的6-BA可提高诱导率。李建民等[13]实验得到类似的结论,2，4-D质量浓度为0.5～2.0 mg/L，辽东楤木愈伤组织诱导效果最佳且褐化率低，当质量浓度升至3.0 mg/L时，则呈现下降趋势。李福安等[10]在对体细胞胚发生的研究中发现2，4-D浓度由0.5mg/L提高到2.0mg/L时愈伤组织才由非胚性愈伤组织形成胚性愈伤组织，但当2，4-D浓度继续提高时，愈伤组织褐化，生长不佳；另外BA与适宜浓度生长素配比，可能起初对愈伤组织胚胎发生的形成有促进作用，而在其后发育中，则抑制胚状体的形成。

与2，4-D相比，NAA可能更有利于胚胎发生及胚状体的形成。陈国双等[16]发现在诱导培养阶段NAA从0到2.0 mg/L，随着浓度增大愈伤组织加大，NAA达到2.0 mg/L时，不定芽有“玻璃化”现象出现，相同浓度NAA较IAA效果好。

1.4 培养条件

1.4.1 温度和光照大多数文献报道，辽东楤木组织培养的温度以25℃左右，光强500～2 000 lx为宜。

1.4.2 pH和接种量王彦为等[17]在基质pH和接种量对辽东楤木愈伤组织培养的影响的研究中发现，辽东楤木愈伤组织培养的最佳pH为5.6，最佳接种量为每瓶0.8 g。

1.4.3 蔗糖浓度和活性炭李福安等[10]报道，适宜浓度的蔗糖（4%）对胚性愈伤组织的诱导有利,在胚胎发生过程中，2%的蔗糖有利于胚状体的产生；活性碳对辽东楤木胚状体发生频率和形态都有重要的作用，0.2%的活性碳使其胚胎发生率较高，胚状体质量较好。

2 再生植株的形成

辽东楤木的根、茎、叶、叶柄、芽均可诱导产生愈伤组织或胚状体，愈伤组织的类型与形态发生能力有一定相关性。李建民等[13]报道，辽东楤木的愈伤组织在分化培养中形成了密布白色霜状物的块状、绿色瘤状、黄褐色颗粒状三类愈伤组织，白色霜状愈伤组织分化出不定芽，可沿愈伤组织途径诱导出芽生根形成再生植株；而黄褐色颗粒状愈伤组织上分化出了胚状体，可沿胚状体途径形成再生植株。再生植株的形成共有两条途径。

以胚状体进行无性繁殖，诱导率和分化率均较高，繁殖速度快，生产集中，管理方便，是很好的繁殖手段，但是胚状体为单细胞起源，变异几率较大。

从辽东楤木外植体诱导愈伤组织中，筛选出可再分化的愈伤组织，诱导其分化出芽再分化出根，最后生长发育为再生植株。

2.2.1 出芽培养芽的诱导培养受激素的种类、浓度、外植体的类型及继代培养时间的影响很大。秦亚平等[9]对5组不同激素浓度的分化培养基进行实验，以MS+6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L培养基分化效果最好，平均诱导分化率为85%。赵恒田等[11]在不定芽分化的实验中表明最适培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L（或IAA 0.2 mg/L），最适于诱导出芽的外植体为幼叶，30 d继代1次分化效率最高，可达73%。李建民等[13]研究发现来源于叶的白色霜状愈伤组织在MA+BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MA+BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L、MA+BA 3 mg/L+NAA 0.5 mg/L 3种培养基上分别形成丛生或单个粗壮的不定芽，分化率分别为10%、14.3%、6.7%。

GA3（赤霉素的一种类型）有促进已分化的芽伸长生长的作用[15]，陈国双等[16]研究了不同浓度GA3对不定芽的影响，结果表明，添加GA3的浓度以0.2 mg/L为宜，分化指数达6.12，浓度过高易引起丛生芽细弱和分化指数降低。

2.2.2 生根培养辽东楤木生根比较容易，生长素类生长调节剂以IBA（0.5～1.5 mg/L）、IAA（0.1～0.4 mg/L）最为常用，细胞分裂素类（BA、6-BA）不添加或低浓度（0.1 mg/L）添加[9-11，18-24]。秦亚平等[9]以MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L为培养基，21 d左右长出白色的根，主根上生有侧根2～3条。赵恒田等[11]研究了不同浓度NAA对生根的影响，结果表明1/2 MS+ NAA 0.5 mg/L培养基最适于诱导生根，培养20 d左右生根达高峰，生根率100%，平均每株生根3.1条，平均根长2.7 cm。李建民等[13]将不定芽接种到1/2 MA培养基上，20 d即可长出根系。陈国双等[16]设置不同浓度NAA、BA、IBA，以1/2 MS+BA 0.1 mg/L+ IBA 0.5 mg/L进行生根培养最好，生根率92%，平均每株生根4.8条。

3 试管苗的移栽

试管苗是否移栽成活直接关系到组织培养繁育能否应用于生产。赵恒田等[11]报道按1∶1混配的蛭石与草炭为试管苗移栽最适基质,移栽成活率在89%以上，且植株生长良好。陈国双等[16]研究表明，以珍珠岩+落叶松腐殖土（1∶1）炼苗效果好，能加速成苗。金今松等[25]在辽东楤木试管苗移栽的研究中表明，试管苗移栽的适宜形态指标是3～4叶期；在温度25℃左右，湿度60%～85%，苗的成活率最高。

4 辽东楤木组织培养常见问题及解决

4.1 褐化在植物组织培养初期，外植体易发生褐变现象，褐化会使组织难以培养，甚至失败，故防止外植体褐变组织培养是不可忽视的关键。适宜的外源激素配比可有效防止外植体褐变。常迺滔等[18]以MS培养基为基本培养基，用NAA（0.01～0.05 mg/L）、6-BA（0.5～1.0 mg/L）的11个不同组合处理，诱导愈伤组织，结果表明：（NAA 0.01 mg/L+6-BA 0.5 mg/L）诱导产生的愈伤组织的褐化率最低。另外，有学者[9]在培养基中加入吸附剂活性炭，其中，5 g/L活性炭防止外植体褐化效果显著。曹孜义等[26]在培养基中加入抗氧化剂维生素C防止外植体褐变。此外还有研究[21]发现，将辽东楤木外植体不断转接到新鲜的培养基上亦可基本防止褐变现象。

4.2 玻璃化降低6-BA含量并把握好琼脂加入量（7.5～8.0 g/L），可有效防止外植体玻璃化的产生[9]。

4.3 细菌污染报道发现[9]，40 μg/L的硫酸链霉素控制细菌的污染效果较好。另外，在培养基中加入青霉素可防止初代培养物的污染。

5 小结

由于辽东楤木的自然繁殖率低及人们的掠夺式开发，导致辽东楤木的野生资源日益减少。现在生产上采用的无性扦插技术，需耗费大量根、茎,不利于野生资源的保护。为了满足市场需求和积极保护野生资源,采用组织培养进行快速繁殖是保持辽东楤木优良性状,加快繁殖速度的有效途径。近年来，国内外的学者对其进行了大量的研究，无论是胚状体成苗还是愈伤组织成苗途径都获得了一定的成果。但是辽东楤木的组织培养仍存在一些问题，如再生苗是否保持了优良的性状，再生苗的病虫害防治和成活率及如何实现辽东楤木组织培养的工业化，这些问题仍需进一步研究。

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A summarization on somatic cell tissue culture of Aralia Elata Seem

ZHANG Yun-feng,XU Rui-zhi,FAN Na,MA Lin
（College of TCM，Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China）

Through consulting and tidying up the related literature materials at home and abroad,this paper summarizes the main research progress on somatic cell tissue culture of Aralia elata.Regenerated plantlets of Aralia elata can be obtained by two ways,one is embryoid into plantlet,the other is divided cluster buds into roots and then inducing roots into seedlings.In the process of somatic embryo and cluster bud induction,explants,culture medium, growth regulating substances and cultivating conditions(inoculation quantity,pH value,sugar concentration, illumination,etc.)all are playing critical roles.

Aralia elata;somatic cell;tissue culture;explant

R285

A

1673－9043（2014）01－0052-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.01.18

2013-09-06）

天津市高等学校“十二五”综合投资规划专业建设项目战略性新兴产业相关专业中药资源与开发项目。

张云风（1991－），女，天津中医药大学中药学院2010级本科生，研究方向为中药资源与开发。

马琳，E-mail:malin7983@yahoo.com.cn。