桃豫农矮砧 1 号外植体灭菌方法的研究

徐志威，杜保伟，熊明国*

（1.河南省农业广播电视学校夏邑分校，河南商丘 476400；2.商丘职业技术学院，河南商丘 476400）

桃豫农矮砧 1 号外植体灭菌方法的研究

徐志威1，杜保伟2，熊明国2*

（1.河南省农业广播电视学校夏邑分校，河南商丘 476400；2.商丘职业技术学院，河南商丘 476400）

[目的]为桃豫农矮砧1号愈伤组织的培养奠定基础。[方法]试验通过75%乙醇与升汞、次氯酸钠、消毒片的不同浓度不同时间组合对桃豫农矮砧1号叶片灭菌效果的比较，探讨合理有效的灭菌方法。[结果]结果表明，75%乙醇与不同浓度的消毒片混合使用的灭菌效果要明显好于75%乙醇与其他灭菌剂混合使用的灭菌效果。其中以75%乙醇灭菌30 s，5.0 g/L消毒片处理8 min效果最好。[结论]桃豫农矮砧1号外植体灭菌以75%乙醇灭菌30 s，5.0 g/L消毒片处理8min效果最好。

桃；矮化砧木；升汞；次氯酸钠；消毒片

桃（Prunus persica）又名普通桃，属于蔷薇科（Rosaceae）桃属桃亚属（Subgen．Amygdalus）植物。在果树组织培养过程中，外植体的灭菌是愈伤组织培养成功的基础环节[1]。桃树为多年生植物，经常遭受内部和外部的微生物侵染，使得从成熟植株上获得的外植体较难消毒。长期以来，研究者们很少对桃树外植体灭菌进行研究[2-3]。污染问题是一大难题，造成污染的原因有很多，可能是外植体带菌、用具灭菌不彻底、操作人员不遵守操作规程等。在果树组织培养过程中，预防污染是一项艰难而重要的工作，需要消耗大量的人力、物力[4-5]。为了减少损失、提高效率，必须在各个操作环节注意防止污染的发生。基于此，该试验就桃豫农矮砧1号叶片，使用不同灭菌试剂和不同灭菌时间组合，对灭菌效果进行筛选，以期找到效果较好的组合，为矮化砧木愈伤组织的培养打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验采用桃豫农矮砧1号的叶片，取材时间为晴天上午10：00左右，取材部位树冠中下层生长健壮枝条先剪下枝条，然后回到实验室从上往下数第5～7片叶子剪下用于试验。经灭菌后接种到愈伤组织诱导培养基中，接种后进行观察，统计污染率。

1.2 方法

试验选用乙醇、升汞、次氯酸钠和爱尔施牌消毒片（有效氯50 mg/g）4种灭菌剂。首先用剪刀将叶片从枝条上剪下来，带一定长度的叶柄，再用洗洁精水浸泡0.5 h。然后置超净工作台上，用无菌水冲洗2次后，再将叶片放置于75%乙醇溶液中浸泡30 s，用无菌水冲洗5遍，再用不同的灭菌剂按不同的浓度和灭菌时间组合对其灭菌。不同灭菌方法设置12个处理（表1），初步判断出灭菌效果后针对某种灭菌剂设置9个处理（表2），经灭菌后接种于初代培养基中，培养条件为培养温度（25±2）℃，光照强度2 000 lx，光/暗周期是16/8 h。培养7 d后观察，统计污染率。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌剂处理对外植体污染率的影响

不同灭菌剂的处理效果方差分析见表1。从污染率来看，消毒片灭菌后污染率明显低于其他灭菌剂，0.2%HgCl2灭菌3 min的处理和5%NaClO灭菌10 min处理，0.1%HgCl2灭菌3 min处理与3%NaClO灭菌10 min处理，0.1%HgCl2灭菌5 min处理和5% NaClO灭菌5 min处理之间的方差分析效果不显著，3%NaClO灭菌5 min和其他处理差异显著，消毒片不同浓度、不同时间组合的处理之间差异显著，其中6.0 g/L消毒片灭菌10 min的处理污染率最低，同时显著差异于其他处理，为最佳处理组合。

表1 不同灭菌剂的灭菌效果

2.2 消毒片不同处理对外植体污染率的影响

消毒片不同浓度与不同时间组合的灭菌效果见表2。从污染率来看，4.0 g/L消毒片处理的污染率明显高于5.0和6.0 g/L消毒片处理，5.0 g/L消毒片中5 min处理与8 min处理和10 min处理差异显著，8 min处理和10 min处理差异不显著，但整体来说低于5min的处理，6.0 g/L消毒片中8 min处理与5 min处理和10 min处理之间差异显著，5 min处理和10 min处理之间差异不显著，但整体效果低于8 min处理。综上分析，5.0 g/L消毒片8 min处理、5.0 g/L消毒片10 min处理、6.0 g/L消毒片5 min处理和6.0 g/L消毒片10 min处理的整体污染率也是最低，但方差分析结果差异不显著，综合考虑高浓度的消毒剂对外植体处理的毒害作用和外植体在培养过程中的生长状态，最终确定最适的灭菌组合为处理17○，即5.0 g/L消毒片处理8 min。

表2 消毒片不同灭菌方法的灭菌效果

3 结论与讨论

通过对不同灭菌剂不同时间组合处理的试验数据分析可以看出，使用75%乙醇与消毒片不同浓度、不同时间组合的灭菌效果明显好于其他的灭菌剂组合。方差分析效果显示，6.0 g/L消毒片10 min处理组合的污染率最低，显著低于其他处理，为最佳处理组合。在分析出消毒片的灭菌效果后又设置了消毒片不同浓度、不同时间组合的处理，从中发现5.0 g/L消毒片和6.0 g/L消毒片的处理效果明显优于4.0 g/L消毒片的处理效果。通过方差分析并综合考虑消毒对外植体的影响，得出结论，以75%乙醇灭菌30 s+5.0 g/L消毒片8 min处理污染率最低，为16.67%，灭菌效果最好。

[1]吴延军，徐昌杰，张上隆.桃组织培养和遗传转化研究现状及展望.果树学报，2002，19（2）：123-127.

[2]周玉碧.桃高效微繁体系的建立与遗传稳定性研究[D].兰州：甘肃农业大学，2005.

[3]李浚明，朱登云.植物组织培养教程[M].北京：中国农业大学出版利，2005.

[4]尚敏克，姜国斌，伊伟伦，等.晚熟桃的离体组织培养[J].辽宁林业科技，2002（3）：5-7.

[5]刘进平，莫饶.热带植物组织培养[M].科学出版社，2006.

（责任编辑 张杨林）

Research on Disinfection Methods of Prunus persica Dwarf Yunong Rootstock No.1

XU Zhi-weiet al.(Xiayi Angeles,Henan Province Agricultural Broadcasting and Television School, Shangqiu,Henan 476400)

[Objective]The aim was to establish the base of the induction of callus in Prunus dwarf rootstock No.1.[Method]The stem segments of thePrunus persicadwarf Yunong rootstock No.1 was disinfected by 75% ethanol and different concentrations different time combination of HgCl2,NaClO,disinfection piece in order to seek the effective disinfection method.[Result]The results indicated that the disinfection effect of treatment 75%ethanol and disinfection piece was better than the mixture of 75%ethanol and others.The best method was used 75%ethanol 30 s+5.0 g/L disinfection piece 8 min.[Conclusion]The best disinfection method of dwarf Prunus Yunong rootstock No.1 was used 75%ethanol 30 s+5.0 g/L disinfection piece 8 min.

Peach;Dwarf rootstock;HgCl2;NaClO;Disinfection piece

S188

A

2095-0896（2014）12-033-02

徐志威（1973-），男，河南夏邑人，农艺师，从事农村农业技术教育研究。*通讯作者，讲师，硕士，从事果树生物技术研究，E-mail：xmg7501@163.com。

2014-12-14