猪Mx1基因的克隆表达及抗病毒活性研究

刘玉洁，赵 协，张廷虹，曹广明，扬志昆

（1.山东省日照市动物疫病预防控制中心，日照 276800；2.山东农业大学动物科技与动物医学院，泰安271018；3.山东省兽药质量检验所，济南 250022）

·研究论文·

猪Mx1基因的克隆表达及抗病毒活性研究

刘玉洁1，赵 协2，张廷虹2，曹广明2，扬志昆3

（1.山东省日照市动物疫病预防控制中心，日照 276800；2.山东农业大学动物科技与动物医学院，泰安271018；3.山东省兽药质量检验所，济南 250022）

本文应用（RT-PCR）技术，从猪瘟弱毒疫苗和Poly:IC共刺激7 h的PK15细胞的cDNA中扩增出编码Mx1蛋白的全长基因，并通过引物设计填补了PK（15）细胞系Mx1 cDNA序列中3'端11bp的缺失，成功获得Mx1完整基因的克隆。构建了重组表达质粒pRetroQ-sMx1，转染HEK293T细胞并表达Mx1蛋白，利用微量细胞病变抑制法测定其抗病毒活性。双酶切鉴定和核酸序列测定证实pRetroQ-sMx1真核表达质粒构建成功，转染HEK 293T细胞后，能够检测到绿色荧光，Western blot 证实为目的蛋白。微量细胞病变抑制法测定重组蛋白具有一定的抗水疱性口炎病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒的活性。重组Mx1具有一定抗病毒生物功能，为进一步研究重组Mx1蛋白的活性以及Mx1抗病毒药物奠定了基础。

Mx1基因；克隆；真核表达；抗病毒活性

Mx基因（myxovirus-resistant），即抗粘液病毒基因，是1963年Lindenmann在A/G小鼠16号染色体上发现的抗流感病毒感染的基因，由于能抵抗粘液病毒而得以命名[1]。Horisberger等[2]发现Mx+细胞经IFNα诱导后比Mx细胞多出1条75 kDa的多肽，而且这种多肽也只是在IFNα/β诱导后产生的，将这种多肽统一命名为Mx蛋白[2]。Mx蛋白是一类大小70～80 kDa的蛋白质，具有广谱的抗病毒效应，是继IFN 2'5'-寡腺苷酸合成酶和P86蛋白激酶之后发现的又一种抗病毒蛋白。1992年，Mullar等[3]首次获得猪Mx蛋白Mx1（76 kDa）和Mx2（73 kDa），并发现猪Mx1蛋白多肽与人的MxA、小鼠的Mx2、大鼠Mx2和Mx3蛋白相似，所有的多肽氨基末端高度保守并有一个三联体，即GTP结合位点。2006年，Thomas 等[4]对猪的Mx1基因进行了基因结构和启动子分析，并进行了Mx1基因的表达研究，提出猪不同品种的Mx1蛋白广泛存在抗病毒活性。猪Mx1基因定位于第13 号染色体上，包含一个含有663个氨基酸的开放式阅读框，和人的MxA 相似，具抗流感病毒的活性，而Mx2蛋白不具备抗病毒活性。为了研究猪Mx1蛋白的抗病毒活性，本试验从猪瘟弱毒疫苗和Poly：IC刺激7 h的PK15细胞提取总RNA，应用RT-PCR技术扩增出编码Mx1蛋白的全长基因，并进行真核表达，获得具有生物话性的Mx1重组蛋白。

1材料与方法

1.1 实验材料大肠杆菌DH5α购自北京全式金公司；载体pRetroQ-AcGFP1-N1和HEK293T细胞株购自美国Invitrogen公司；PK15细胞由本实验室保存。

1.2 引物设计参照GenBank 发表的Mx1基因序列（登录号：AB164037）设计引物，将其全长cDNA序列删除终止密码子，在上游引物中加入NheⅠ酶切位点，下游引物中加入SalⅠ酶切位点，并加入6个组氨酸基因序列6-His标签基因，引物由上海生工合成。上游引物：5′-GCGCTAGCGAAGATGGTTTA TTCCAGC-3′；下游引物：5′-TAGTCGACATATG GTGATGGTGATGATGGCCTGGGAACTTGGCGA GC-3′。

1.3 Mx1蛋白的诱导当PK15细胞长成良好单层后，加入猪瘟弱毒疫苗，置于37℃、5%CO2条件下诱导活化3 h，使之产生干扰素，然后收集诱导液，Poly：IC再于相同的条件下联合诱导活化7 h，收集细胞培养物，以备总RNA的提取之用。

1.4 细胞总RNA的提取及RT-PCR按照TRIzol RNA提取试剂盒说明书从细胞组织培养物中提取总RNA，溶于无RNAse的DEPC水中。取2 μL RNA用AMV反转录酶反转录猪Mx1的cDNA，并以此为模板，进行PCR。

1.5 重组T质粒的构建和缺失基因的修复纯化PCR回收产物，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选鉴定阳性克隆，并通过引物设计填补PK（15）细胞系Mx1 cDNA序列中3′端11 bp的缺失，获得猪Mx1蛋白完整基因的克隆。

1.6 pRetroQ-sMx1重组质粒的构建与鉴定用NheⅠ和SalⅠ分别酶切载体pRetroQ-AcGFP1-N1和重组T质粒，用DNA胶回收试剂盒回收酶切片段。回收片段按目的基因和载体浓度为2:1，在T4DNA连接酶作用下4℃连接12 h，转化DH5α感受态细胞。经氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆菌落，摇菌提取质粒，进行双酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆送上海生工进行DNA测序，将完全正确的质粒命名为pRetroQ-sMx1。

1.7 重组质粒转染HEK293T细胞和荧光检测质粒DNA加入适量含血清和抗生素的DMEM中，混匀。另一管中用同样的DMEM将100 μmol/L 的PEI 储存液稀释成10 μmol/L，充分混合。将两种溶液充分混匀后室温静置20～30 min，逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀，置于含5%～7% CO2的37℃温箱孵育4 h，吸出转染液，换成10%胎牛血清的DMEM完全培养液继续培养48 h，在荧光显微镜下观察。

1.8 重组蛋白的Western blot鉴定大量转染重组pRetroQ-sMx1质粒，将转染48 h后的细胞用PBS洗脱、收集，加入蛋白酶抑制剂，超声波破碎细胞，离心取上清。将上清进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，用封闭液按1:200稀释6×His单克隆抗体，将硝酸纤维膜置于其中，室温下摇摆孵育4 h，PBS摇摆洗涤3次，每次10 min。用封闭液按1:500稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，将硝酸纤维膜置于其中，室温下摇摆孵育2 h，PBS摇摆洗涤3次，每次10 min。用DAB显色试剂盒避光显色，观察结果并拍照。

1.9 重组Mx1蛋白的抗病毒活性实验采用Reed-Muench法，首先在细胞板上测定水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）和猪繁殖呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的半数感染量TCID50。将重组表达的Mx1蛋白提取液倍比稀释，加入到含有鸡胚成纤维细胞或Marc-145细胞的96孔细胞培养板中，再分别加入100TCID50VSV或PRRSV，然后利用微量细胞病变抑制法，测定表达产物的抗病毒作用。

2 结果

2.1 Mx1基因的RT-PCR扩增从PK15细胞提取总RNA，进行RT-PCR扩增。取PCR 产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，约2000 bp附近有1条特异性条带，与预期相符（图略）。

2.2 重组质粒pRetroQ-sMx1鉴定重组质粒pRetroQ-sMx1经NheⅠ和SalⅠ酶切，可切出8000 bp和2000 bp大小条带，与预期大小一致（图略）。

2.3 重组质粒pRetroQ-sMx1 瞬时表达的检测转染48 h后用倒置荧光显微镜观察重组质粒在HEK293T细胞中转染效率及表达情况，结果显示，正常细胞对照组未能检测到绿色荧光（图1A），而转染pRetroQ-sMx1实验组检测到较强的荧光信号（图1B）。

图1 pRetroQ-sMx1在HEK293T细胞中瞬时表达的检测Fig.1 Detection of transient expression of pRetroQ-sMx1 in HEK293T cellsA: HEK293T 细胞对照; B: pRetroQ-sMx1重组质粒转染HEK293T 细胞A: HEK293T cell control ; B: Transient expression of pRetroQ-sMx1

2.4 表达蛋白的Western blot检测利用抗6×his单克隆抗体对重组质粒表达产物进行Western blot检测，可见到一条约70 kDa的阳性条带（图2），其大小与重组Mx1蛋白相符合。

2.5 抗病毒活性试验

2.5.1 抗VSV 鸡胚成纤维细胞-水疱性口炎病毒系统上测定表达产物的抗病毒作用。加入VSV培养24～48 h后，在倒置显微镜下观察。正常的鸡胚成纤维细胞形态呈纤维状，紧贴细胞瓶壁生长，单层良好，排列规则，细胞内颗粒物少（图3A）。VSV感染细胞后，出现细胞病变，细胞逐渐变圆，脱落，死亡，细胞单层崩解，脱落，形成合胞体（图3B）。加入重组Mx1蛋白保护的成纤维细胞只有部分细胞出现了细胞病变，大部分细胞抵抗了VSV的感染（图3C），说明Mx1对VSV的感染有一定的抵抗能力。

2.5.2 抗PRRSV 采用微量细胞病变抑制法，在Marc-145细胞-猪繁殖与呼吸综合征病毒系统上测定表达产物的抗病毒作用。加入PRRSV培养24～48 h后，PBS漂洗2次，75%乙醇固定，然后分别加入抗PRRSV血清和FITC-兔抗猪IgG孵育，在倒置荧光显微镜下观察。结果显示，Marc-145细胞被PRRSV攻毒后大部分细胞被病毒感染，IFA检测大部分细胞显示绿色荧光（图4A），而加入重组Mx1蛋白保护的Marc-145细胞只有部分细胞被病毒感染显示绿色荧光（图4B），说明Mx1对PRRSV感染有一定的抵抗能力。

图2 pRetroQ-sMx1表达蛋白的Western blot鉴定Fig.2 Western blot analysis of recombinant Mx1 protein1:重组Mx1蛋白；M:蛋白质分子量标准1: Recombinant Mx1 protein; M: Protein Marker

图3 鸡胚成纤维细胞-水疱性口炎病毒系统上测定重组Mx1的抗病毒作用Fig.3 Detection of antiviral to VSV of recmbinant Mx1

A: 鸡胚成纤维细胞对照; B: 水疱性口炎病毒感染的鸡胚成纤维细胞; C: 加入pRetroQ-sMx1表达蛋白抵制VSV感染的成纤维细胞

A: Chicken embryo fi broblast cell control; B: Chicken embryo fi broblast cell infected with VSV; C: Chicken embryo fi broblast cell infeced with VSV after dealed with recombinant Mx1 protein

图4 Marc145-PRRSV系统上测定表达产物的抗病毒作用Fig.4 Anti-virus function of Mx1 in Macr-145A: Marc-145细胞感染PRRSV; B: 加入pRetroQ-sMx1表达蛋白抵制PRRSV感染的Marc-145细胞A: Marc-145 infected with PRRSV; B: Marc-145 infeced with PRRSV after dealed with recombinant Mx1 protein

3 讨论

Mx已被证实是一种体内细胞天然存在的抗病毒基因，可被IFNα/β（I型干扰素）、病毒及双股RNA（dsRNA）等诱导。不同的Mx蛋白具有不同的抗病毒特异性，在抗病毒机理上也稍有不同。细胞核内Mx蛋白可以选择性地抑制正粘病毒的最初转录，而细胞质内Mx蛋白除可抑制正粘病毒的复制外，还可抑制弹状病毒、副粘病毒以及布尼病毒的复制。

Horisberger等[2]研究发现诱导猪细胞的Mx1蛋白可以抑制流感病毒、水疱性口炎病毒和门戈病毒的生长。陈蕾等[5]、陈胜峰等[6]证明鸡Mx1蛋白具有抗新城疫病毒的攻效。Zhang等[7]研究认为感染PRRSV会诱导猪Mx1 的表达。Chung等[8]通过急性感染PRRSV的猪细胞INF-α和Mx1的表达研究，发现INF-α和Mx1对宿主早期抵抗PRRSV的感染有很重要的作用。这预示猪Mx1蛋白可能在猪某些病毒性疾病中起到一定预防和治疗作用。本研究证明外源性重组猪Mx1具有一定的抗VSV和PRRSV的活性，为进一步研究Mx1蛋白在猪病毒性疾病预防与治疗方面的作用，及开发具有抗病毒活性的Mx1蛋白制剂奠定了基础。

[1] Lindenmann J, Lane C A, Hobson D . The resistance of A 2 Gmice to myxoviruses [J]. J Immunol, 1963, 90: 942-951.

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EUKARYOTIC EXPRESSION AND ANTIVIRAL ACTIVITY OF PORCINE MYXOVIRUS RESISTANCE GENE (Mx1)

LIU Yu-jie1, ZHAO Xie2, ZHANG Ting-hong2, CAO Guang-ming2, YANG Zhi-kun3
(1. Animal Disease Prevention and Control Center of Shandong Province, Rizhao 276800, China; 2. Animal Science and Animal Medical College, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China; 3. Inspection of Veterinary Drug Quality Inspection, Jinan 250022, China)

The present study was to clone Myxovirus resistance protein Mx1 for eukaryotic expression and detect its antiviral activity. The RNA coding for Mx1 was extracted from PK15 cells that were stimulated for 7 hours with swine fever vaccine and Poly real: IC. Subsequently, full- length Mx1 gene was amplifi ed in RT-PCR using primers designed to rescue 11 bp missing in PK 15 cell line. The recombinant expression plasmid pRetroQ - sMx1 was constructed and used to transfect HEK293T cells for expression. Success of Mx1 expression in HEK293T cells was confi rmed through double enzyme identifi cation, determination of nucleic acid sequence, detection of green fl uorescence and Western blot. Cytopathic effect inhibition assay was used to measure antiviral activity of expressed Mx1.

Mx1 gene; clone; eukaryotic expression; antiviral activity

S852.651

A

：1674-6422（2014）04-0035-05

2013-11-15

山东省科技攻关项目（2009GG10009011）

刘玉洁，女，硕士，助理研究员，主要从事动物疾病实验室检测

扬志昆，E-mail：yzk5709@sina.com