宁波樱花根癌病病原细菌鉴定

王志龙， 金杨唐， 谭志文， 王国良， 林 立

（1.宁波城市职业技术学院，宁波 315502；2.浙江万里学院生物与环境学院，宁波 315100）

宁波樱花根癌病病原细菌鉴定

王志龙1， 金杨唐2， 谭志文2， 王国良2， 林 立1

（1.宁波城市职业技术学院，宁波 315502；2.浙江万里学院生物与环境学院，宁波 315100）

摘要从浙江宁波14个樱花（Cerasus Mill.）病株样本上分离到多株土壤农杆菌菌株，其中10个菌株可致指示寄主番茄形成肿瘤，对菌株Czx-3的16S r DNA序列比对，确定樱花根癌病是由根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染所致。进一步开展的标准生化和生理反应测试、碳源利用和选择性培养基等试验，鉴定出7个根癌病菌株为土壤农杆菌（A.tumefaciens）生物型2型，占70%，为优势种群，其余3个菌株为生物型1型。对樱花根癌病菌分类地位的确定，樱花种苗的检疫和病害控制奠定了理论基础。

关键词樱花； 根癌病； 病原细菌； 16S rDNA序列分析； 鉴定

樱花（Cerasus Mill.）是我国重要的观赏花木，被广泛用于美化公园、小区、道路等绿地，多年来樱花苗木需求量大，产业市场前景广阔。浙江省宁波的四明山区域具有优越的气候和立地条件，十分适合樱花生长。目前浙江省四明山区域内的余姚市、奉化市和鄞州区等地樱花苗木种植面积超过3 000 hm2，占全国总面积的70%以上，每年产值近3亿元，占全国60%～70%的市场份额，是名副其实的“樱花之乡”。生产销售樱花苗木已成为四明山区域农民最主要的经济来源，许多花农因此发家致富，走上小康之路。

根癌土壤杆菌［Agrobacterium tumefaciens（Smith et Townsend）Conn］为土壤习居菌，寄主范围极广，可侵染93科331属643种的植物，包括多种果树、林木、花卉，甚至瓜类，在生产上造成非常大的损失，1996年就被列入国内森林植物检疫对象名单［1］。樱花根癌病由根癌土壤杆菌引起，最明显的症状是在根茎处产生球状或半球状瘤状物，瘤状物慢慢地随着苗木的长大而长大，严重影响了樱花苗木生长速度和树势，降低了观赏品质和商品价值。病害发生轻时引起提前落叶，严重时可引起整树枯死，被花农称为樱花的“癌症”，防治樱花根癌病的最有效方法是检疫和培育无菌苗木，但是，多年来检疫和培育无菌苗木工作没有跟上，樱花根癌病在各地大面积发生，随着栽培时间的增长，病害发生程度逐年加重。据我们对本地樱花主要苗木生产基地初步调查，发现宁波市樱花主栽区平均发病率达30%，销售的干径5 cm左右樱花苗木发病率达15%～50%，重发区块植株患病率甚至达到92%。倪大炜［2］确定引起浙江省慈溪等地的日本樱花苗圃内日本樱花根癌病的病原细菌全部为根癌土壤杆菌生物型1型，刘保友［3］的研究表明，烟台地区大樱桃根癌病样本，生物型2型占69.57%，为优势种群，其余菌株为生物型1型。

本研究旨在明确樱花根癌病病原细菌的分类地位，为樱花根癌病的深入研究和防治奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病组织采集

2012年10月分别从四明山区多个樱花苗木场和宁波市区内樱花种植数量比较多的公园、学校、小区等场所，选择樱花树根茎处具有明显根瘤症状部位，用刀切取新鲜根瘤的病组织。取样樱花树的树龄10～20年。

1.2 病原菌的分离

切取新鲜根瘤病组织表层后切成大小约5 mm× 5 mm的小块，15%漂白粉溶液消毒3 min，0.1%升汞溶液消毒50 s，无菌水清洗3次。将经上述处理的小块放入无菌研钵内，加入适量灭菌水研碎，直至完全研磨后静置5 min。用接种环蘸取上清液，在LB培养基上画线分离，28℃培养。阳性菌株A.tumefaciens cfcc-1369（分离于樱桃根癌）由中国林业微生物菌种保藏管理中心提供，也进行同样画线、培养。以cfcc-1369菌株培养48 h后的菌落特性为依据，进行革兰氏染色，同时制临时玻片在显微镜下观察菌体形态特征和活动特点。对具有典型根癌菌菌落和菌体形态特征及活动特点的单个菌落，再次在LB培养基上画线培养。48 h后对各分离菌株制片，在JEM-1011型电子显微镜下观察细菌的形态特征，分离得到纯化的菌株，备用。

1.3 致病性测定

从种子公司购买番茄种子，品种为‘红圣女’，催芽后种植在直径10 cm，内装2／3泥炭培养基的塑料培养钵内，每钵种3株，在28℃、12 h光照、85%相对湿度的人工培育室内培养，根据泥炭培养基水分情况及时浇水。培养45 d后选择生长一致的番茄苗，在2～3叶之间的主茎表面用75%乙醇棉表面消毒，用无菌解剖针轻轻刺番茄主径9～10针，造成微小创伤。将分离纯化到的14株菌株和cfcc-1 369菌株在LB液体培养基培养2 d，用灭菌水调节细菌悬浮液浓度至（1～1.5）×108cfu／m L，用药棉蘸细菌悬浮液包裹于创伤处48 h，同时设药棉蘸灭菌水包裹于创伤处作空白对照，两星期后调查创伤处肿大和瘤肿情况。

1.4 供试菌株16S r DNA序列分析

根据致病性试验结果，进行了样品2号Czx-3菌株的16S r DNA序列分析。

1.4.1 主要试剂和仪器

DNA提取试剂盒为TIANGEN TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）；PCR试剂盒为大连宝生物Ta KaRa Taq TM（DR001A）；PCR扩增仪器为Mastercycler pro银制梯度PCR仪。

1.4.2 细菌基因组的提取

参照TIANGEN TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）说明书进行提取。

1.4.3 PCR扩增与测序

通用引物由上海生物工程有限公司合成：F8：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG（5′-3′），R1492：ACGGCTACCTTGTTACGACTT（5′-3′），目的片段约为1 500 bp。

扩增体系（25μL体系）：10×PCR buffer 2.5μL，dd H2O 18μL，Taq 0.5μL，模板1μL，F8（10μmol／L）1μL，R1492（10μmol／L）1μL，d NTP 1μL。扩增条件：94℃，10 min；94℃，1 min；58℃，1 min；72℃，1 min；共30个循环；72℃延伸10 min。电泳条件：1%的琼脂糖凝胶，电泳缓冲液1×TBE，凝胶成像系统观察成像，并保存。PCR产物送上海生工进行PCR产物纯化并测序。

1.4.4 目标细菌的16S r DNA序列分析

将16S r DNA PCR产物序列提交NCBI（http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）中进行比对。

1.5 生理生化试验

将经过致病性试验后的有致病能力的10个菌株和cfcc-1369菌株进行生理生化试验。

1.5.1 常规培养基生长试验

参照刘保友［3］的方法对病菌的生长温度、耐盐性、3-酮基乳糖和碳源利用等开展试验。将各菌株接种在相应的培养基上，28℃培养48 h检查细菌生长情况。

1.5.2 选择性培养基试验

Schroth培养基：培养基组分参照Schroth［4］。Kerr＆Brisbane培养基：培养基组分参照New［5］。Roy＆Sasser培养基：培养基组分参照Roy［6］。将各菌株画线接种在Schroth培养基、Kerr＆Brisbane培养基、Roy＆Sasser培养基上，28℃培养48 h检查细菌生长情况。

2 结果与分析

2.1 病菌分离

分离纯化到的14株菌株和cfcc-1369菌株在LB培养基的特征为稍微隆起，有光泽，边缘完整，半透明、乳白色、黏稠圆形菌落。显微镜下观察细菌的形态特性，菌体细胞杆状，常见2～3个菌体连成长杆状，单菌体和长杆状菌体都能游动。革兰氏染色反应阴性。在LB液体培养基培养2 d时混浊生长。电子显微镜下观察菌体形态，可见菌体清晰明亮，短杆状，大小为（1.6～2.3）μm×（0.6～0.9）μm，周生鞭毛数根（见图1）。

图1 樱花根癌病菌Fig.1 The pathogen of Cerasus crown gall

2.2 致病性测定

14株菌株经过致病性检测试验，在指示植物番茄上表现出致病性的有10株菌，另外4株没有致病性。具致病性菌株中8株引起肿大（图2中），2株引起多个小瘤状突起（图2左），空白对照没有明显变化（图2右）。cfcc-1369菌株引起肿大。

2.3 供试菌株16S r DNA序列分析结果

2.3.1 PCR扩增结果

应用通用引物F8／R1492进行PCR扩增，得到约1 500 bp的目的产物，如图3所示。

图2 樱花根癌菌在番茄主茎上的致病性测定Fig.2 Determination of the pathogenicity of A.tumefaciens in tomato stems

2.3.2 序列结果比对分析

PCR产物纯化之后，对其进行双向序列测定。利用NCBI网站中的BLAST程序将产物序列与数据库中的序列进行比对分析，设定参数为网站默认模式，结果为样品2号Czx-3菌株和cfcc-1369菌株的PCR产物的16S r DNA全长1 350 bp序列与A.tumefaciens strain TA-AT-6（登录号：KF673154）的16S r RNA基因的相似性达到100%，可认为它们属于同一种。

2.4 生理生化和菌株生物型试验

生理生化和菌株生物型试验结果见表1。

结果表明，A.tumefaciens的3个生物型均不能在37℃环境中生长；生物型1和3均可在含有2% NaCl的培养基上生长；生物型1在3-酮基乳糖试验中可以生长；生物型1可利用蔗糖和乙醇，生物型3只可利用蔗糖，而生物型2不可利用蔗糖和乙醇；3种选择性培养基中，生物型1只能在Schroth培养基生长，生物型2只能在Kerry＆Brisbane培养基生长，而生物型3只能在Roy＆Sasser培养基上生长。根据以上生物型区分标准的试验表明：本研究中的10株具致病能力的樱花根瘤病菌中，有7株是生物型2型，3株是生物型1型。cfcc-1369是生物型2型。

图3 细菌16S r RNA基因扩增图Fig.3 Amplification of bacterial 16S r RNA

表1 菌株生物型鉴定结果1）Table 1 Diagnostic characters for determination of A.tumefaciens biotypes

3 结论

根癌病是一种危害性极大的世界性细菌病害。本研究从宁波各县市区采集樱花根癌病样本，通过培养形态观察和致病性测定试验，对样品Czx-3菌株的16S r DNA序列比对，确定樱花根癌病是由根癌土壤杆菌（A.tumefaciens）侵染所致。筛选出14个典型的根癌菌株，再经生理生化反应、选择性培养基筛选等试验测定，对比《伯杰细菌鉴定手册》土壤杆菌菌种的鉴定［7］，明确了引起本地樱花根癌病的病菌A.tumefaciens生物型2为优势种群，生物型1也占30%。

本地樱花根癌病菌分类地位的确定可为今后病原菌的深入研究，开展种苗检疫和有针对性地防治提供一定的理论基础。无论是从遵守国家植物检疫法或是从为本地樱花苗木产业可持续发展角度考虑，研究、开发出一套适合当地产业发展需要的快速检测、培育、销售无樱花根癌病种苗的综合配套技术具有理论意义和实践意义，也是樱花苗木产业可持续发展的必经之路。

参考文献

［1］ 宋玉双.十九种林业检疫性有害生物简介（2）［J］.中国森林病虫，2005，24（2）：32-37.

［2］ 倪大炜，沈杰，张炳欣.日本樱花根癌病病原菌的鉴定及其防治［J］.微生物学通报，1999，26（1）：11-14.

［3］ 刘保友，张伟，栾炳辉，等.大樱桃根癌病原细菌分类地位鉴定［J］.湖北农业科学，2009，48（10）：2437-2439.

［4］ Schroth M N，Thompson J P，Hildebrand D C.Isolation of the Agrobacterium tumefaciens A.radiobacter group from soil［J］.Phytopathology，1965，55：645-647.

［5］ New P B，Kerr A.A selective medium for Agrobacterium radiobacter biotype 2［J］.Journal of Applied Bacteriology，1971，34（1）：233-236.

［6］ Roy M A，Sasser M.A selective medium for Agrobacterium tumefaciens biotype 3［J］.Phytopathology，1983，73：810.

［7］ 布坎南R E，吉本斯N E.伯杰细菌鉴定手册［M］.第8版.北京：科学出版社，1984.

联系方式 E-mail：wangzhl01＠163.com

中图分类号：S 436.85

文献标识码：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.027

收稿日期：2014-01-28

修订日期：2014-03-14

基金项目：国家星火计划重大项目（2012GA701002）；国家星火计划一般项目（2012GA701014）；宁波市农业社会发展重点项目（2012C10010）；宁波市科技局“双创”项目（2011C91011）

Identification of the pathogen from Cerasus crown gall in Ningbo

Wang Zhilong1， Jin Yangtang2， Tan Zhiwen2， Wang Guoliang2， Lin Li1
（1.Ningbo City College of Vocational Technology，Ningbo 315502，China；2.College of Biological &Environmental Sciences，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

AbstractStrains were obtained from 14 samples of crown gall on Cerasus Mill.in Ningbo，Zhejiang Province，China，10 of which could form crown gall tomato.The pathogen was identified as Agrobacterium tumefaciens based on phenotypic features of the cells and colonies，biochemical characteristics and sequence analysis of 16S r DNA.These strains were further identified based on reactions to standard biochemical and physiological tests by carbon utilization and selective media for identification.Among the 10 strains，7 were biotype 2，accounting for 70% of the total.The other 3 strains were biotype 1.The finding that A.tumefaciens could cause crown gall disease of Cerasus laid the foundation for systematic study on quarantine and disease control.

Key wordsCerasus Mill.； crown gall； pathogenic bacterium； 16S r DNA sequence analysis； identification