小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发和室内人工接种方法的探索

姚 卓， 陈万权， 高 利， 刘太国， 刘 博

（中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发和室内人工接种方法的探索

姚 卓， 陈万权*， 高 利， 刘太国， 刘 博

（中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

摘要小麦矮腥黑穗病是由小麦矮腥黑粉菌（Tilletia controversa Kühn，TCK）引起的我国对外一类检疫性病害。本项研究对其病菌冬孢子的萌发、人工接种方法进行了室内试验。结果表明，参试菌株冬孢子在土壤浸提液培养基上45～50 d时达到萌发高峰，冬孢子浓度对萌发率有影响，浓度为（100～105）×104个／m L时萌发率最高。因此，可以选用此浓度作为室内TCK冬孢子萌发研究的适宜浓度。在室内进行TCK冬孢子的人工接种方法的研究表明，冬孢子在培养基上萌发后，将麦种放在培养皿盖中的湿滤纸上，置于5℃的培养箱中培养，直到苗长到3～5 cm，然后将麦苗种植到直径为24 cm的塑料盆中，在白天30℃，夜晚18℃的生长箱中培养至植株成熟，可获得7%左右的发病植株。

关键词小麦矮腥黑粉菌； 冬孢子萌发； 人工接种试验

小麦矮腥黑穗病是由小麦矮腥黑粉菌（Tilletia controversa Kühn，TCK）引起的重要国际检疫性病害，也是我国对外检疫的一类危险性植物病害。该病害危害大、防治难，一旦传入会给小麦生产带来毁灭性危害，通常发病率约等于小麦产量损失率［1-2］。据Hoffmann报告，在流行年份，因TCK引起的损失率一般为20%～50%，最高可达75%～90%［3］。除了产量损失外，被侵染的小麦出粉率也会随着感染严重程度而降低，并且因含有TCK冬孢子而极大地影响品质。1935年Young［4］根据小麦矮腥黑穗病病株矮化明显、分蘖多、病穗紧密及病粒硬等特征，将其与小麦普通腥黑穗病区分开。目前该病害已在欧洲、北美、南美、大洋洲、亚洲、非洲等约49个国家发生。这些发病地点均在北纬30°和南纬30°以上的中纬度地区。TCK的寄主范围很广，危害小麦、大麦、黑麦等禾本科18个属的70多种植物，其中，对小麦危害最严重［5］。该病在栽培条件下的主要寄主为冬小麦，我国常年小麦种植面积约2 300万hm2，其中冬小麦占绝大部分，随着我国加入WTO及与TCK疫区国家美国小麦贸易的增加，TCK传入我国的可能性日益增大。目前国内关于小麦矮腥黑粉菌在室内条件下完成侵染循环过程的研究较少，不能明确小麦矮腥黑穗病病害循环过程中各阶段的环境条件。探索小麦矮腥黑粉菌的室内人工接种方法，并完成病菌的侵染循环过程，将有助于在室内隔离条件下进行小麦矮腥黑粉菌生物学研究，包括病菌不同小种的致病性、小麦品种抗病性研究等，防止在室外条件下进行研究时出现病菌扩散的情况，造成严重后果，进而从各方面加强对该病的防治。

1 材料与方法

1.1 TCK冬孢子浓度对萌发的影响

供试菌株为2011年从口岸截获的小麦矮腥黑粉菌。小麦矮腥黑粉菌冬孢子的表面消毒处理和萌发参照王吉霞等的方法［6］。从病穗中取1粒菌瘿，置于2 m L离心管中，加入适量蒸馏水浸泡菌瘿，静置30 min，然后将菌瘿捣碎并充分振荡，用150目网筛过滤后，将滤液放在室温下培养24 h，低速离心后弃去上清液，加0.25%NaCl O水溶液并在室温下放置1 min进行表面消毒，用灭菌水洗3次，利用血球计数板将冬孢子在灭菌水中调至不同浓度：（5～10）×104、（25～30）×104、（50～55）×104、（75～80）×104、（100～105）×104、（125～130）×104、（150～155）×104、（175～180）×104个／m L。

将配制好的冬孢子悬浮液加入预先做好的土壤浸提液培养基平板（1 000 m L培养基中含有20 g琼脂、5 mg 80万IU青霉素、75 g土壤）上，每皿加冬孢子悬浮液0.25 m L，并用无菌三角玻璃棒均匀涂抹培养基表面，每个浓度重复3次。用封口膜封好后倒置放于5℃的光照培养箱中培养，光照强度为600 lx。

从培养15 d之后开始，每5 d镜检观察1次，每个培养皿观察400个孢子。以先菌丝长到冬孢子直径的1／2时视为萌发，记录萌发起始时间、萌发数目及生长情况。

1.2 TCK的室内人工接种方法研究

供试菌株同上。接种寄主：‘东选3号’。接种前，将小麦种子用30%NaOCl水溶液表面消毒5 min，无菌水冲洗3次，以便杀死种子表面可能携带的TCK和小麦网腥黑粉菌孢子。然后将小麦种子浸种催芽，待胚芽鞘长度为1～3 mm时备用。

接种方法一：小麦在接种前需经过春化处理，春化温度为4℃，春化时间约4周。当约70%的冬孢子萌发时，在每个土壤浸提液培养基中放入4～5 g种子和5 m L冷水（约5℃），用消毒过的玻璃棒混合，直到种子湿润并均匀覆盖病菌。接种必须在担孢子开始解体前进行，单个担孢子有泡则表明已解体。将接种后的种子播于直径24 cm塑料盆中，深度约5 cm，每盆种10粒种子。在10℃下培养，直到幼苗出土良好，时间约2周。然后将幼苗移至高温室中培养，白天温度约25℃，夜间温度约13℃，进行常规管理，将植株种植至成熟。

接种方法二：将接有冬孢子悬浮液的小麦种子（同方法一）播种在直径11 cm塑料盆的潮湿蛭石中，播种深度为5 cm，然后用一层铝箔覆盖，放在10℃下培养2周左右。然后将幼苗移到盛有灭菌土的直径为24 cm的塑料盆中，每盆约10株，置5～10℃下至少8周，进行春化处理，然后将植株放在白天30℃，夜晚18℃的人工气候培养箱中种植至植株成熟［7］。

接种方法三：将种子放在培养皿盖中的湿滤纸上，然后将皿底盛有一层承载萌发孢子的土壤浸提液培养基倒置过来，使培养基上承载萌发冬孢子的一面与小麦种子接触，放在5℃的培养箱中培育，并可通过这段时间的低温对小麦进行春化处理，直到苗长到3～5 cm。然后将幼苗种植到直径为24 cm的塑料盆中，放在白天30℃，夜晚18℃的人工气候培养箱中种植至植株成熟［8］。

接种方法四：将小麦种子压入培养基中，TCK冬孢子在培养基表面进行萌发，把种子的胚并列对着孢子。小麦萌发时改变培养基的位置，使胚芽鞘能沿培养基表面生长。接种后，将培养皿放置在10℃的生长箱中，直到麦苗的胚芽鞘长到3～5 cm。然后将麦苗种植到盛有灭菌土的直径为24 cm的塑料盆中，放在白天30℃，夜晚18℃的人工气候培养箱中种植至植株成熟［8］。

2 结果与分析

2.1 不同TCK冬孢子浓度对其萌发的影响

不同浓度下参试菌株冬孢子的萌发率变化如图1所示。由图1可以看出，TCK菌株冬孢子在最适温度5℃下，不同冬孢子浓度下的菌株起始萌发时间最短为15～20 d，大部分菌株为25 d。通过对TCK冬孢子萌发过程的系统观察发现，TCK冬孢子萌发后先长出先菌丝，在琼脂培养基上，有的菌株先菌丝在产生初生担孢子前大量生长，先菌丝长短差异较大（图2a）。有的菌株可在冬孢子上观察到多个萌发孔，在同一冬孢子上产生多条先菌丝（图2b）。丝状的初生担孢子是从先菌丝顶部开始生长，形成密集的一束（图2b），起初先菌丝没有隔膜，正常萌发的冬孢子在培养35 d以后先菌丝一端开始产生隔膜，并可观察到先菌丝的顶端长出初生担孢子和冬孢子融合后形成的H体和接合钉（图2c）。45 d左右开始有少量的初生担孢子顶端长出腊肠状的次生担孢子（图2d）。此结果与王吉霞［6］的结果基本一致，各阶段孢子形态如图2所示。

图1 TCK不同冬孢子浓度对萌发的影响Fig.1 Effects of different concentrations of TCK teliospores on the germination rate

图2 TCK冬孢子萌发过程中不同阶段的形态（10×）Fig.2 Form of TCK teliospore germination at different stages（10×）

从图1中还可以看出，不同浓度的参试菌株在45～50 d达到最高萌发率，约为60%～75%，与Meiners的研究结果一致［8］。利用SAS8.0进行方差分析结果表明，在45～50 d参试菌株在浓度达到（100～105）×104个／m L时，与高浓度参试菌株的萌发率差异达到显著水平，随着浓度的升高，萌发率差异不显著（表1）。

2.2 室内人工接种方法的研究

采用不同方法进行人工接种后，对小麦不同生长时期病害症状进行系统观察（图3）。在小麦生长初期，病叶片上表现为微小、不清晰或清晰的黄斑和／或条纹（图3f）。受侵染的植株易产生异常矮化分蘖，病穗的茎秆通常缩短。受侵染的小花未成熟子房呈深绿色，而健康的子房则呈浅绿色。发育完全的孢子团一般呈籽粒状，但比正常籽粒圆且大，这使得内外稃张开，使病穗呈现特征形态（图3g）。成熟孢子团由冬孢子组成并被薄而修饰过的子房壁包被（图3i）。孢子团散发出与鱼腥味相似的强烈气味。病害一般仅在病株的某些分蘖中发生。在4种接种方法中，方法一和方法三分别获得了3.33%和6.66%的发病麦穗。

表1 45 d和50 d时不同浓度下TCK冬孢子的萌发率1）Table 1 Germination rate of TCK teliospores under different concentrations after culture of 45 d and 50 d

图3 TCK侵染循环示意图Fig.3 Sketch map of TCK infection cycle

3 结论与讨论

目前有关TCK冬孢子萌发的研究主要是其与环境因子之间的关系。王吉霞等研究了温度对TCK冬孢子萌发的影响，试验结果表明，TCK冬孢子萌发的温度范围为－2～12℃，其中5℃为萌发的最佳温度［6］。贾文明等对土壤湿度对TCK冬孢子萌发的影响进行了研究，结果表明，TCK冬孢子在土壤质量含水量为1%～28%（相对含水量3.57%～100%）范围内均可萌发，其适宜萌发的土壤含水量范围为10%～25%（相对含水量17.85%～89.3%），最佳土壤相对含水量范围在65%～75%之间［9］。江辉等研究了TCK不同菌株冬孢子萌发对温度的敏感性，进一步明确不同菌株TCK冬孢子萌发对温度的反应，菌株在相同的培养条件下，随着保存年限的增长，冬孢子的萌发率会逐渐下降［10］。本试验通过设计TCK冬孢子的浓度梯度，研究浓度与冬孢子萌发之间的相关性，试验结果表明，不同浓度的TCK冬孢子对萌发有一定影响，冬孢子浓度在（100～105）×104个／m L以下时，其萌发率随浓度增加逐渐升高。相关研究表明，腥黑粉菌具有鱼腥味的化学物质三甲胺可抑制TCK冬孢子萌发［11］，其他冬孢子未知的内源化合物也能抑制萌发［12］，可能由于高浓度的自我抑制化合物而使残存在孢子堆中的冬孢子不萌发［13］。在本试验中，当浓度达到一定范围时，冬孢子的萌发率反而逐渐降低，也证明了上述研究内容。因此，在人工接种试验中，需要较高冬孢子萌发率，以确保病菌能够侵入小麦体内，并在寄主体内进一步扩展，引起小麦发病，所以在冬孢子萌发试验过程中，应通过选择合适的冬孢子浓度，年代较近的菌株以及控制温度和湿度等环境条件，以确保冬孢子有较高的萌发率。

国内关于TCK冬孢子人工接种试验的相关研究较少，在大连、北京、天津等地室外采用将TCK冬孢子撒在土壤表面的接种方法得到了大量TCK病株（章正，王圆等，未发表资料）。易建平将接种萌发TCK冬孢子的小麦种子在5℃光照（12 h／d）条件下培养21 d或29 d后，移植于塑料周转箱中，按照小麦常规田间管理措施管理，直到收获，该试验获得了发病麦穗，这是单个萌发TCK冬孢子造成小麦发病的第一次报道［14］。但该试验发病率较低，且将冬孢子接种小麦后移植到室外培养，环境条件可控性较差。本试验在国内外前人研究的基础上，探索了不同的冬孢子室内接种方法，并严格控制小麦生长各阶段的环境条件，所采用4种接种方法，其中2种方法得到了TCK病穗，但发病率均较低。可能原因有：（1）病菌的侵入时期与小麦的感病时期不一致，导致病菌未能侵入小麦体内；（2）接种后，土壤等环境条件可能不利于冬孢子生长，导致病菌未能侵入小麦体内；（3）麦苗从低温培养箱中移至高温培养箱后温度突然升高，麦苗生长迅速，大部分病菌未能侵入到小麦生长点。但本试验仍然得到了部分发病植株，证明可在室内条件下完成TCK的整个侵染过程。在本试验的基础上，通过对试验条件进一步优化，如使种子与病菌长时间充分接触，有利于病菌的侵入；严格控制病菌侵入时期的低温（约5～10℃）、高湿（约65%～75%）的环境条件；改善土壤理化条件，使其适合病菌生长及侵入小麦体内，将有可能得到较高的发病率。如果能在室内条件下得到稳定的TCK发病率，将能进一步通过TCK的鉴别寄主来确定不同病菌小种的致病性，以及目前我国现有主栽小麦品种对致病性高的病菌小种的抗病性，有助于有效评估TCK对我国小麦生产的风险，并从栽培抗病品种等方面入手加强对小麦矮腥黑穗病的控制。

参考文献

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中图分类号：S 435.121.4

文献标识码：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.021

收稿日期：2013-05-05

修订日期：2013-06-18

基金项目：国家“973”计划项目（2009CB119200，2010CB951503，2011CB100403）；现代农业产业技术体系岗位科学家（CARS-03-04B）；农作物病虫害疫情监测与防治

*通信作者E-mail：wqchen＠ippcaas.cn

Germination of teliospores and artificial inoculation of Tilletia controversa Kühn

Yao Zhuo， Chen Wanquan， Gao Li， Liu Taiguo， Liu Bo
（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

AbstractDwarf bunt of wheat，caused by Tilletia controversa Kühn is an international quarantine disease on wheat in China.Germination of teliospores and infection of T.controversa by different artificial inoculation methods were tested in the laboratory.The results indicated that the germination rate reached to its peak on the 45th－50th day in the soil extract agar medium.Concentration of teliospores had an impact on germination rate with the highest at the（100－105）×104／m L，which can be used for the inoculation concentration in the greenhouse.The wheat seeds were put on the wet filter paper in the cover of the soil extract agar medium with the germinated teliospores，the medium was overturned and incubated at 5℃until wheat seedlings grew to 3－5 cm，then the wheat seedlings were transplanted to the 24-cm-diameter plastic pots and kept in the growth chamber at 30℃during the day and 18℃during the night until the matured plants.The diseased plants reached to about 7%.

Key wordsTilletia controversa（TCK）； germination of teliospores； artificial inoculation test