高效液相-乘方指纹图谱评价防风通圣丸质量

吴 玉， 孙国祥， 李闫飞， 刘中博

（沈阳药科大学药学院， 辽宁 沈阳 110016）

高效液相-乘方指纹图谱评价防风通圣丸质量

吴 玉， 孙国祥*， 李闫飞， 刘中博

（沈阳药科大学药学院， 辽宁 沈阳 110016）

目的 建立防风通圣丸反相高效液相色谱指纹图谱， 用多维乘方指纹图谱评价样品质量。 方法 选用 Poroshell 20SB-C18色谱柱 （150mm×4.6mm， 2.7 μm） ， 流动相为甲醇-1%冰醋酸水溶液， 体积流量 0.5mL/min， 进样量5 μL，柱温 （30.0 ±0.1）℃， 检测波长 265 nm。 结果 以黄芩苷为参照物峰， 确定 59 个共有指纹峰， 以 8 级系统指纹定量法评价12批样品质量， 并测定各批次样品中黄芩苷、 黄芩素和汉黄芩素的量。 结论 高效液相结合乘方指纹图谱能更准确监测样品中防风通圣丸有效成分含有量差异。

防风通圣丸；高效液相；乘方指纹图谱；8级系统指纹图谱

中药指纹图谱以其综合、宏观、可量化特点被选作有效评价中药质量的重要手段，也被国际采用［1-2］。中药指纹图谱包括色谱 指纹图 谱、 光谱指纹图谱和分子生物指纹图谱等，尤以色谱指纹图谱应用广泛，但存在不足。国家药典委员会颁布夹角余弦相似度法奠定了指纹图谱评价基础，但大峰严重掩蔽小峰导致结果失真，这对中药质量控制十分不利。本实验基于色谱指纹峰面积大小提出乘方指纹谱评价模式，旨在对中药系统指纹定量鉴定进行有益补充。防风通圣丸出于金代名医刘完素的《宣明论方》，为外散风邪、 内清蕴热的表里双解剂， 《中国药典》［3］收载常规检查和鉴别， 文献有防风通圣丸药效成 分含量分析法［4-8］。 因防 风通圣丸含有17味药， 化学成分十分复杂，很难全面科学地控制其质量。本实验建立防风通圣丸高效液相色谱指纹图谱结合 8 级系统指纹定量法 （8LSQFM）， 用乘方指纹图谱评价防风通圣丸质量，同时结合多组分含量测定，为中药质量控制提供新的评价模式。

1 乘方指纹图谱评价模式

Sm代表宏定性相似度； SF代表定性相似度；S'F代表比率定性相似度； P8%代表 8 级宏定量相似度； α代表指纹均化性变动系数； QF代表校正含量相似度；P代表定量相似度；C代表投影含量相似度；n 代表指纹峰数； xi，yi分别代表样品指纹图谱和对照指纹图谱各峰的峰面积。

表1 8级系统指纹定量法鉴定中药质量标准Tab.1 Quality level assessed by 8L-SQFM

2 实验部分

2.1 仪 器 与 试 剂 Agilent1100 型 液 相 色 谱 仪，ChemStation 工作站 （ Agilent科技有限公司）， 甲醇（色谱纯， 山东禹王实业有限公司禹城化工厂），冰醋酸 （色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）， 无水乙醇 （分析纯， 康科德科技有限公司），水为去离子水。 对照品黄芩苷 （baicalin），批号为110715-200514， 供含量测定用， 购自中国药品生物制品检定所。 对照品黄芩素 （baicalein）和汉黄芩苷 （ wogonin）， 批 号 分 别 为 110705 和 111514-200403，均供含量测定用， 购自上海融禾医药科技有限公司。12 批防风通圣丸： S1 ～S12 均购自沈阳药店。

2.2 样品溶液制备 取防风通圣丸一袋， 约 6 g，碾碎， 精密称定， 加入 40 mL甲醇回流提取 1 h，过滤， 残渣加入 30 mL 75%乙醇再回流提取 1 h，合并两次滤液， 减压浓缩至约5 mL， 转移至25 mL量瓶中， 用甲醇定容至刻度， 摇匀， 用 0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作供试液。

2.3 混合对照品溶液制备 分别精密称取黄芩苷，黄芩素和汉黄芩素对照品适量，用甲醇溶解并稀释制成黄芩苷 1.2 mg/mL、黄芩素 1.2mg/mL、 汉黄芩素 0.3 mg/mL的混合对照品溶液。

2.4 色谱条件 Poroshell120SB-C18柱 （150 mm× 4.6 mm， 2.7 μm）， 流动相为甲醇 （A） -1.0%冰醋酸水溶液 （ B）， 梯度洗脱 （0 ～20 min， 0 ～25%A； 20 ～35 min， 25% ～40%A； 35 ～55 min，40% ～60%A； 55 ～60 min， 60% ～67%A； 60 ～80 min，67% ～100%A； 80 ～92 min， 100%A）；体积流 量 0.5 mL/min； 检 测 波 长 265 nm， 柱 温（30 ±0.1）°C， 进样量 5 μL， 洗脱时间 92 min。

3 结果与讨论

3.1 系统适用性试验 将 S7 供试品溶液、 黄芩苷、 黄芩素和汉黄芩素对照品溶液分别进样 5 μL，记录色谱图。比较保留时间和在线紫外光谱可知31、 42 和 46 号峰分别为黄芩苷、 黄芩素和汉黄芩素。 按黄芩苷记理论板数不低于 400 000， 其中黄芩苷与相邻峰分离较好，故选黄芩苷为参照物峰。2 h空针和样品指纹图谱表明 92 min 内出峰完全，无干扰， 故洗脱时间为 92 min。

3.2 方法学考察

3.2.1 精密度， 稳定性和重复性试验 按 “2.2”项下样品溶液制备方法制备样品，为考察仪器精密度， 取 S7 供试液连续进样 6 次； 分别在配制 S7 供试液后 0、6、12、 18 和 24 h， 进样测定以考察样品溶液稳定性； 平行制备 S7供试液6份进样测定，以参照物黄芩苷的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，其相对保留时间 RSD均小于 2.0%， 相对峰面积 RSD均小于3.5%。 结果表明仪器精密度、样品稳定性和方法重复性均符合指纹谱技术要求［14］。

3.2.2 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液0.03、 0.2、 1.0、 2.0、 5.0 mL， 分别置于 10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。将上述5个混合对照品溶液及混合对照品贮备液均进样分析，记录色谱图。 以对照品质量浓度 （mg/m L） 为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的标准曲线分别为 y=4 999.4x+191.61（r=0.999 7 ）、 y=6 983.8x+20.924 （r= 0.999 8）、 y=12 908x+205.11 （r=0.999 8）。 结果表明 3 组 分分别在 0.018 ～6.0 μg， 0.018 ～6.0 μg和 0.004 5 ～1.5 μg内呈良好线性关系。

3.2.3 加样回收试验 分别制备 S7 样品 5 份供试液，向其中加入混合对照品溶液适量，混匀，按照“2.4” 项色谱条件测定， 计算 3 组分的平均回收率， 分别为 103.7%、 106.2%、96.8%， RSD依次为 1.8%、1.9%、1.6%。

3.3 265 nm-HPLC指纹图谱建立与评价 将 12 批防风通圣丸供试液分别进样检测并记录色谱图见图1 （A），以黄芩苷为参照物峰， 按峰出现率 100%计确定59 个共有指纹峰。 将12 批样品指纹图谱按均值法［15］计算对照指纹图谱 （ RFP） 并评价 12 批样品质量， 见表 2 正常指纹图谱 （N-FP）， 结果 S1质量劣 （8 级），S2 质量一般 （6 级）， S3、 S4、S6、 S8 和 S9 质 量 中 （5 级）， S5、 S10、 S11 和S12 质量良好 （4 级）， S7 质量很好 （2 级）。

图 1 12 批防风通圣丸-HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of the 12 batches of Fangfeng Tongsheng Pills

3.4 多维乘方指纹图谱评价防风通圣丸质量 用N-FP原数据 计算 S-FP、 1.5PFP、 ST-FP和 CT-FP如图 1 （B-E）。 S-FP和 1.5PFP有效地突出了大峰权重，但忽略小峰贡献，乘方次数越高越显著。ST-FP和 CT-FP则相反， 均突出小峰贡献而降低大峰权重，使大小峰均化，开方次数越大越明显。评价结果见表 2， 在正常指纹图谱 （N-FP） 评价结果中， S7 质量等级最高 （2 级）， 表明 S7 质量最好，同时在其他四种图谱处理方法中 S7 对应的质量等级均为最高，由此可见乘方指纹图谱可以准确评价样品质量。

表 2 评价 12 批防风通圣丸质量结果Tab.2 Evaluation results of 12 batches of FFTSPs

3.5 样品测定 12 批防风通圣丸样品 3 成分测定结果见表 3， 黄芩苷为 0.34 ～5.06 mg/g， 黄 芩 素为 0.30 ～4.29 mg/g， 汉 黄 芩 素 为 0.19 ～ 0.75 mg/g。 其中在 S1 中黄芩素和汉黄芩素均未检出， 定量指纹图谱评价 S1的质量为劣， 两种评价方法结果一致。

表 3 12 批防风通圣丸中 3 成分测定结果Tab.3 Determ ination of three constituents in 12 batches of Fangfeng Tongsheng Pills

4 结论

本实验建立了 265 nm时防风通圣丸的 N-FPs、S-FPs、 1.5PFPs、 ST-FPs和 CT-FPs多维乘方指纹图谱， 采用 8级系统指纹定量法评价 12 批样品质量。 N-FP能准确反映防风通圣丸成分含有量特征、指纹均一性及内在总指纹成分含有量变化，但可能存在大峰掩蔽小峰现象，因此采用多维乘方指纹图谱综合评价12批防风通圣丸质量。 开方指纹图谱能消除大峰掩盖小峰效应，高方次指纹图谱则突出大峰作用。多组分定量测定作为辅助评价方法，比较测定结果发现，不同批次样品中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的量不同，这可能是由于生产工艺或生产过程中的差异导致的，也可能是由于源药材产地等的影响。指纹图谱可以从整体上评价中药质量，与多组分定量测定相结合，可以更准确监测样品中有效成分含有量差异。比较指纹图谱评价结果和含量测定结果不难发现两种方法互为补充，相辅相成，为中药指纹图谱评价及中药现代化提供了新思路。

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Evaluation of Fangfeng Tongsheng Pills by HPLC com bined w ith involution fingerprint

WU Yu， SUN Guo-xiang*， LIYan-fei， LIU Zhong-bo
（College of Pharmacy， Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang 110016， China）

AIM To establish RP-HPLC fingerprint of Fangfeng Tongsheng Pills， and evaluate the quality of Fangfeng Tongsheng Pills by involution fingerprint.METHODS The analysis was performed on Poroshell 20SBC18column （150 mm×4.6 mm，2.7 μm） and column temperaturemaintained at（30.0 ±0.1）℃， and methanol-1.0%glacial acetic acid waterwas used asmobile phase， the flow rate of0.5mL/min and the sample injection size of 5 μL were adopted.Wavelength was set at 265 nm.RESULTS Choosing baicalin peak as the reference peak and 59 fingeprint peakswere identified.Assessment of the 8th level systematically quantified fingcrprintmethod based on RP-HPLC combined with involution fingerprint was used for twelve batches of Fangfeng Tongsheng Pills.CONCLUSION RP-HPLC combined with involution fingerprintmethod can well reflect the quantity of Fangfeng Tongsheng Pills.

Fangfeng Tongsheng Pills； HPLC； involution fingerprint； the 8th level systematically quantified fingerprintmethod

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）05-1021-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.029

2013-06-18

国家自然科学基金重大研究计划课题 （90612002）

吴 玉 （1980—） ， 女， 硕士， 研究方向： 中药指纹图谱。 Tel： 13591645073， E-mail： wuyuwuyu1990@163.com

*通信作者： 孙国祥 （1962—）， 男， 博士， 教授， 博士生导师， 研究方向： 中药指纹学体系及其信息学。 Tel：（024）23986286， E-mail： gxswmwys@163.com